順鉑通過促進microRNA-214表達抑制肝癌細胞增殖

劉子文，杜永星，由 磊，舒 紅，趙玉沛

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院基本外科，北京100730)

肝細胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，近年來的流行病學資料顯示其發(fā)病率和病死率在全球范圍內均呈現(xiàn)出逐年攀升的趨勢［1］。盡管對高危人群的血清腫瘤標志物及超聲影像學篩查，可以使肝細胞癌患者在早期得以診斷并通過手術切除、肝移植或射頻等手段根治，但最終仍易出現(xiàn)復發(fā)和轉移，導致患者死亡［2］。肝主動脈灌注化療(hepatic arterial infusion chemotherapy，HAIC)是用于肝癌晚期或者手術患者輔助治療的常用策略，對改善某些選擇性患者的預后效果顯著［3-5］。目前，已有多種化療藥物用于HAIC，包括順鉑、5 氟尿嘧啶、吡柔比星及多柔比星等。其中，順鉑做為一種廣譜抗腫瘤藥物，可通過影響DNA 復制，參與細胞周期調控。但是，有關順鉑的抗腫瘤機制仍存在不明之處，對一些與腫瘤發(fā)生密切相關的分子或信號通路的影響尚不清楚。miR-214 在肝細胞癌中表達下調，發(fā)揮抑癌基因的作用，研究顯示，β-catenin 是其功能靶基因，miR-214-β-catenin 調控異常可促進肝癌細胞增殖與侵襲［6-7］。本研究將探討順鉑對miR-214 及其靶基因β-catenin 表達的影響，揭示順鉑抑制肝細胞癌進展的新機制。

1 材料與方法

1.1 材料

30 例肝細胞癌組織(北京協(xié)和醫(yī)院基本外科收集，男19 例，女11 例，平均年齡55 歲，所有患者均經過醫(yī)學倫理學認證并簽署知情同意書)。正常肝細胞總RNA(上海美季生物工程公司)，肝癌細胞系HepG2、Hep3b 和Huh7(本實驗室保存)，DMEM 培養(yǎng)基(Gibco 公司)，胎牛血清(Hyclone 公司)，Trizol 試劑(Invitrogen 公司)，miR-214 表達分析試劑盒(Taqman 公司產品)，miR-214 抑制劑(anti-con)及相應陰性對照品(Dharmcon 公司)，轉染試劑Effectene(Qiagen 公司)，β-catenin 與GAPDH 抗體(Abcam 公司)，HRP 標記羊抗鼠lgG(Santa Cruz 公司)，增強發(fā)光劑(Pierce 公司)，CCK-8 細胞增殖分析試劑盒(同仁化學研究所)，其他所用試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取、real-time PCR 分析:RNA 提取按照Trizol 說明書進行;反轉錄及miR-214 real-time PCR，按照Taqman 公司操作說明進行。

1.2.2 細胞培養(yǎng):HepG2、Hep3b 和Huh7 細胞用DMEM 完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素)，在5% CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱內常規(guī)傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)增殖期的細胞進行實驗，各項實驗至少重復3 次。

1.2.3 Western blot 檢測:經不同濃度順鉑處理的HepG2 與Hep3b 細胞中β-catenin 的表達水平。

1.2.4 CCK-8 檢測細胞增殖:檢測各組細胞的增殖活性。將生長狀態(tài)良好的HepG2 細胞接種于96孔板，轉染時細胞達到每孔30% ～50%。分別在轉染后12、24、36、48 和60 h，取出培養(yǎng)板，每孔加CCK-8 10 μL (5 g/L)，置37 ℃，5% CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)1 ～4 h。用酶標儀測波長為450 nm 的各吸光度值(A450值)。每組設3 個復孔，取均值繪制細胞生長曲線。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 miR-214 在肝細胞癌組織及細胞系中表達下調

與癌旁組織相比，miR-214 在肝細胞癌組織中表達明顯下調(P＜0.01)(圖1A);與正常肝細胞總RNA 相比，miR-214 在肝癌細胞系HepG2、Huh7 和Hep3b 中的表達亦下調，分別下調約52%、89%和46%(圖1B)。

2.2 順鉑促進肝癌細胞內源性miR-214 的表達

順鉑在HepG2 與Huh7 細胞中的IC50分別為47.29 和24.6 mg/L(圖2A)。與對照組(PBS)，經不同濃度順鉑處理的HepG2 與Hep3b 細胞，其內源性miR-214 的表達水平明顯上調(圖2B)。

圖1 miR-214 在肝細胞癌組織及細胞系中表達下調Fig 1 miR-21 expression is downregulated in HCC tissue specimens and cell lines (±s，n=3)

圖2 順鉑促進肝癌細胞內源性miR-214 的表達Fig 2 Cisplatin leads to an augment of endogenous miR-214 levels in HepG2 and Hep3b cells(±s，n=3)

2.3 順鉑抑制miR-214 靶基因β-catenin 的蛋白表達

與對照組相比，以47.29 和24.60 mg/L 順鉑處理的HepG2 與Hep3b 細胞，其內源性miR-214 分別上調2.3 和2.2 倍(圖3A)。β-catenin 的表達水平則明顯下調(圖3B)。

2.4 抑制miR-214 可以降低順鉑對HepG2 細胞增殖的阻遏

與順鉑聯(lián)合miRNA 抑制劑對照(anti-con)處理相比，Anti-214 可以抑制順鉑對內源性miR-214 表達的激活作用(圖4A)，后續(xù)細胞增殖實驗顯示，anti-214 可以部分拮抗順鉑對HepG2 細胞增殖的抑制(圖4B)。

圖3 順鉑抑制miR-214 靶基因β-catenin 的表達Fig 3 β-catenin expression is downregulated in cisplatintreated HepG2 and Hep3b cells(±s，n=3)

圖4 敲低miR-214 的表達可以有效拮抗順鉑對HepG2 細胞增殖的抑制作用Fig 4 Silencing of miR-214 prevents the inhibitory impact of cisplatin on cell growth in HepG2 cells(±s，n=3)

3 討論

MiRNAs 表達失控與多種疾病密切相關，如糖尿病、心血管疾病及惡性腫瘤等［8］。與惡性腫瘤發(fā)生相關的miRNAs 根據(jù)其表達水平與功能研究，可分為癌miRNA(onco-mir)或抑癌miRNA(tumor-suppressive miRNA，ts-mir)［9］。已有報道顯示，onco-mir與ts-mir 的表達與腫瘤進展及預后存在密切關系，可成為治療的靶點和診斷或預后的生物標志物，例如miR-21、miR-122a 等在肝細胞癌中的診斷價值和靶向意義［10-12］。

近來的研究則顯示，miRNA 的表達水平與化療敏感性存在密切關系［13-14］。順鉑作為一種肝細胞癌化療的常用藥物，是否可以通過調控miRNA 所介導的基因網絡發(fā)揮其抑癌效果尚不清楚。本實驗選擇miR-214 與順鉑的關系開展研究，miR-214 在肝細胞癌組織中表達下調，通過對其靶基因的調控發(fā)揮抑癌基因的作用。表達分析顯示，順鉑可以明顯上調肝癌細胞內源性miR-214 的表達水平，并抑制其靶基因β-catenin 的蛋白表達，從而發(fā)揮其治療效果。

在拯救實驗中，采用順鉑與miR-214 抑制劑聯(lián)合對照，組成不同的處理組，完成miR-214 的表達干預，后續(xù)細胞增殖分析顯示，抑制miR-214 可以降低順鉑對肝癌細胞增殖的阻遏作用，進一步明確了順鉑可以通過調控miR-214 的表達，影響其調節(jié)的靶基因網絡，進而發(fā)揮抑制肝癌進展的作用。總之，本項研究揭示了順鉑抑制肝癌細胞增殖的潛在機制，為其在肝細胞癌化療中的應用提供了一種新的理論依據(jù)。

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