MIBG對人肝癌HepG2細胞增殖的影響

劉逢秋，管小琴，王婭蘭，蘇 晏

(重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學教研室，分子醫(yī)學與腫瘤研究中心，重慶400016)

單腺苷二磷酸核糖基化(mono-ADP-ribosylation)是由單腺苷二磷酸核糖基化轉移酶(mono-ADP-ribosyltransferases，mono-ARTs)催化的一種蛋白轉錄后修飾，其將ADP-核糖從NAD +轉移到受體蛋白特定的氨基酸位點如精氨酸、半胱氨酸殘基上。又可根據(jù)接受單腺苷二磷酸核糖基化作用的不同氨基酸種類，將其分為4 種亞型。精氨酸特異性單腺苷二磷酸核基化就是其中重要一種［1］。

MIBG 是一種去甲腎上腺素神經遞質胍類似物。放射性131I 標記的MIBG 在臨床上作為腫瘤靶放射藥物來診斷和治療腎上腺腫瘤。而未放射標記的MIBG 可以影響多種細胞生物學功能。目前研究發(fā)現(xiàn)MIBG 能夠特異性抑制精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化的功能。因MIBG 其化學結構與精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化轉移酶催化的底物結構類似，從而可以競爭性抑制精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化作用［2］。通過加入MIBG 能引起細胞膜到細胞核的一系列信號的傳導的改變最終可抑制平滑肌細胞增殖和遷移［3］。

本實驗通過使用MIBG 抑制精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化作用，進一步探究其對肝癌HepG2 細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

新生小牛血清(四季青公司);RPMI-1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶(HyClone 公司);PMSF，PIPA 裂解液(Beyotime);MIBG(Sigma 公司);ART1 多克隆抗體(SANTA 公司與Sigma 公司);兔抗山羊IgG/FITC標記抗體(中衫金橋);RhoA，c-myc 多克隆抗體(武漢山鷹公司);cyclin A1 多克隆抗體(博士德生物);辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(北京博奧森);BCA 試劑盒(碧云天公司)。

1.2 細胞的培養(yǎng)及處理

1.2.1 細胞的培養(yǎng):人肝癌HepG2 細胞株用含10%新生小牛血清、100 U/mL 青霉素及100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，待細胞匯合至80%左右。PBS 清洗3次加入胰蛋白酶消化離心后傳代處理。

1.2.2 細胞免疫熒光實驗檢測:ART1 在HepG2 中的表達:將滅菌處理后的玻璃爬片放入6 孔板中，HepG2 細胞以1 ×106cells/L 接種于6 孔板，待細胞匯合至玻璃爬片60% 左右，取出爬片PBS 清洗3次。用10%甲醛固定30 min，在用PBS 清洗3 次每次2 min，加入0.5% Triton 處理15 min，PBS 洗2次，每次5 min。然后1%牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min，在用1∶100 的ART1 抗體4 ℃孵育過夜，對照組PBS 代替一抗做陰性對照。過夜后PBS 清洗3次，每次5 min，加入濃度為1∶50 的兔抗山羊IgG/FITC 標記抗體，37 ℃避光雜交孵育1 h。孵育完畢后再用PBS 清洗3 次，每次5 min。最后用熒光抗淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.3 噻咗藍(MTT)比色實驗檢測細胞生存:HepG2細胞以1 ×106cells/L 接種于96 孔板，200 μL/孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，加入MIBG 至所需的不同濃度，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄去上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，輕輕振蕩10 min，使甲臜溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上，490 nm 波長測定各孔吸光值。細胞生存率=［(實驗組吸光值－空白組吸光值)/(對照組吸光值－空白組吸光值)］×100%。

1.2.4 流式細胞儀測定細胞周期:HepG2 細胞以1 ×106cells/L接種于6 孔板，2 mL/孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，加入MIBG 至所需的不同濃度，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。用0.25%胰蛋白酶消化細胞，制成細胞懸液并用PBS 洗滌，離心后棄上清液，重新懸浮于4 ℃預冷的0.9%氯化鈉注射液中，緩慢加入－20 ℃預冷的95%乙醇，使其終濃度為70%。固定4 h 后流式細胞周期檢測。

1.2.5 Western blot 檢測蛋白表達:將各組培養(yǎng)的細胞裂解之后提取蛋白，然后用BCA 試劑盒測定各組蛋白濃度。5∶1 體積與蛋白上樣緩沖液混合，沸水中水浴5 min。按每孔相同蛋白總量加入凝膠，ART1、c-myc、cyclinA1 和β-actin 用10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，RhoA 用15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。然后再電轉到0.45 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封閉1 h。一抗c-myc、cyclinA1 濃度1 ∶300，ART1、RhoA 濃度1∶200，β-actin 濃度1∶500 4 ℃過夜。吐溫20/三羥甲氨基甲烷緩沖液(TBST)清洗3 次后用1∶1 000辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG 孵育2 h，加入ECL 化學顯影試劑后凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，檢測蛋白質印跡條帶。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 細胞的免疫熒光

熒光顯微鏡下見HepG2 的胞膜、胞質均有熒光。而用PBS 陰性對照的HepG2 細胞中則沒有(圖1)。

2.2 MTT

50μmol/L MIBG 開始，呈劑量依賴性抑制細胞存活(P＜0.05)(表1)。

2.3 流式細胞儀測定細胞周期

隨著MIBG 濃度的增加，處于S 期的細胞比例也隨之增加(P＜0.05)(圖2，3)。

2.4 Werstern bolt

與對照組比較，實驗組ART1、RhoA、c-myc 和cyclinA1 蛋白表達水平降低。4 個指標各組間兩兩比較均有差異(P＜0.05)(圖4)。

圖1 細胞免疫熒光法檢測人肝癌細胞HepG2 中ART1 的表達情況Fig 1 The expression of ART1 in hepatoma carcinoma HepG2 cells detected by cellular immunofluore scence method(taken the pictures by fluores cence microscope，×400)

圖2 流式細胞術檢測不同濃度MIBG 處理后的HepG2 細胞周期Fig 2 HepG2 cell cycle phases treated with different concentration of MIBG analysed by flow cytometry

表1 不同濃度MIBG 處理HepG2 細胞后MTT 法測量A 值以及細胞存活率Table 1 Effects of different concentration of MIBG on cell growth and cell survival rate in human HepG2 detected by MTT(±s，n=3)

表1 不同濃度MIBG 處理HepG2 細胞后MTT 法測量A 值以及細胞存活率Table 1 Effects of different concentration of MIBG on cell growth and cell survival rate in human HepG2 detected by MTT(±s，n=3)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control group．

concentration(μmol/L)MTT assay(A value/well)cell survival rate(%)0(Con．)1.222 ±0.024100 501.114 ±0.019*90.665 ±0.406*1001.027 ±0.053＊＊83.208 ±3.093＊＊1500.853 ±0.021＊＊68.259 ±0.643＊＊2000.854 ±0.032＊＊68.300 ±1.391＊＊2500.537 ±0.014＊＊41.103 ±0.478＊＊3000.474 ±0.012＊＊35.689 ±0.223＊＊

圖3 不同濃度MIBG 對HepG2 細胞周期的影響Fig 3 Effects of different concentration of MIBG on HepG2 cell cycle phases(±s，n=3)

3 討論

單腺苷二磷酸核糖基化有4 種類型，而精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化作用是其中最重要的一種［1］。目前，關于精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化功能的生物學研究主要在結腸癌以及平滑肌細胞。精氨酸特異性單腺苷核糖基化作用能夠影響結腸癌侵襲轉移以及參與腫瘤細胞凋亡過程［4-5］。因此，通過使用精氨酸特異性單腺苷核二磷酸糖基化轉移酶抑制劑MIBG，來探究其是否具有抑制腫瘤細胞增殖的作用。

催化精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化作用的ARTs 目前已發(fā)現(xiàn)多種亞型，不同的亞型在不同種屬和部位分布各不同。在目前已知的5 種ARTs中，只有ART1，2 和5 具有精氨酸特異性單腺苷核糖基化轉移酶的催化位點。因為ART2 在人類體內尚未發(fā)現(xiàn)，ART5 主要富集于睪丸中［6］。所以，初步推測在人體內ART1 是催化精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化作用的主要酶。

圖4 蛋白印記實驗檢測各組中ART1，RhoA，c-myc，cyclinA1 蛋白表達水平Fig 4 The expressions of ART1，RhoA，c-myc，cyclin A1 proteins in HepG2 cells in different groups were respectively detected by Western blot(±s，n=3)

首先，通過細胞免疫熒光顯示ART1 在HepG2細胞具有高表達，該結果提示HepG2 細胞中具有精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化這一蛋白質翻譯后修飾作用。再通過功能實驗MTT 以及流式細胞周期的分析表明，精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化抑制劑MIBG 能夠抑制肝癌HepG2 細胞增殖，且主要是阻滯在S 期。

RhoA 蛋白是Rho 蛋白中最具代表性的一種，其也屬于Ras 家族蛋白中一員。具有激活和失活兩種狀態(tài)，可通過Rho/RhoA 激酶(Rho kinase，ROCK)通路將胞膜信號傳導至胞核，從而調節(jié)c-myc 基因的表達［7-8］。c-myc 可以激活cyclin A 蛋白的表達［9］。細胞周期的調控主要由細胞周期素cyclins和細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent protein kinases，CDKs)這兩類蛋白家族調控。cyclin A1在細胞周期S 期調節(jié)中起著關鍵作用［10］。

研究證明小鼠結腸癌細胞ART1 基因沉默后，精氨酸單腺苷二磷酸核糖基化作用減弱，RhoA 的表達活化水平降低。從而影響到ROCK 細胞信號通路，引起下游c-myc 的表達降低，可抑制小鼠結腸癌細胞的增殖［11］。

為了探究MIBG 抑制HepG2 細胞增殖的機制，進一步檢測了ART1，RhoA、c-myc、cyclinA1 的表達。結果顯示，加入MIBG 后的HepG2 細胞ART1、RhoA、c-myc 和cyclinA1 表達水平降低。提示RhoA通路參與調節(jié)了肝癌HepG2 細胞增殖過程。通過加入MIBG 后，降低了ART1 表達水平和RhoA 的活化水平，進一步下調細胞核內c-myc 蛋白的表達水平，減低了cyclinA1 的表達。從而使HepG2 細胞發(fā)生S 期阻滯，增殖受到抑制。

本實驗發(fā)現(xiàn)MIBG 對人肝癌HepG2 細胞增殖具有抑制作用，為臨床肝癌治療和藥物研究提供了新的靶點。MIBG 對其他腫瘤細胞增殖影響以及在其他生物學行為如凋亡、侵襲轉移等的影響以及是如何調控ART1 表達下調的機制還有待進一步研究。

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