數字攝像頭和生物顯微鏡對顯微圖像定量分析的影響

陳錦龍 李精秀 藍永洪

1.海南醫學院病原生物學教研室，海南海口571199；2.海南醫學院形態學實驗室，海南海口571199

數字攝像頭和生物顯微鏡對顯微圖像定量分析的影響

陳錦龍1李精秀2藍永洪2

1.海南醫學院病原生物學教研室，海南海口571199；2.海南醫學院形態學實驗室，海南海口571199

目的探討數字攝像頭和生物顯微鏡對顯微圖像定量分析的影響情況。方法以物鏡測微尺為研究標定，將不同數字攝像頭安裝同一生物顯微鏡（不同攝像頭組）和同一數字攝像頭安裝不同生物顯微鏡（不同顯微鏡組）后對測微尺進行攝像，應用圖像分析軟件分別測試不同測微尺圖像每微米所代表的像素值，并對測試結果進行分析比較。結果CX31顯微鏡下DPIXEL200、DP520DC、MD20、YM310和DP26所攝取的測微尺圖像每微米所代表的像素值分別為（2.398±0.011）、（5.217±0.019）、（4.770±0.012）、（4.764±0.020）和（4.437±0.023），差異有高度統計學意義（P＜0.01）；而CX31、CX41、B204TR和BK-FL4顯微鏡下DPIXEL200攝取的測微尺圖像每微米所代表的像素值分別為（2.398±0.011）、（2.400±0.009）、（2.409±0.013）和（2.395±0.012），差異無統計學意義（P＞0.05）。結論數字攝像頭對顯微圖像定量分析影響明顯，而生物顯微鏡則影響不明顯。

顯微圖像定量分析；數字攝像頭；生物顯微鏡

顯微圖像定量分析是指用量化的方法以數字表達形式對顯微圖像中各種結構信息的定量描述及在此基礎上對顯微圖像所作的定量分析、推理、判斷和概括[1-2]。顯微圖像定量分析主要立足在顯微圖像上，顯微圖像的攝取方式直接關系到顯微圖像定量分析的結果，而顯微圖像的攝取必須依賴連接計算機的數碼顯微鏡，組織切片或細胞涂片經生物顯微鏡放大后，由數字攝像頭中的CCD圖像傳感器采集下來，通過圖像采集卡轉化為數字信號輸入計算機，這就是所要定量分析的顯微圖像[3-4]。因此同一顯微鏡上的不同攝像頭，或者不同顯微鏡上的同一攝像頭所采集的顯微圖像有可能存在差異，而這種差異是否影響顯微圖像定量分析結果。同時顯微圖像的結構特點可通過結構參數值的大小體現出來，顯微圖像定量分析的結構參數包括幾何學參數（平面結構和三維結構參數），光度學參數（灰度、吸光度和色度學參數等）以及在幾何學參數或光密度參數基礎上測算出的特化參數（陽性單位、DNA指數和細胞增生指數等）[5-6]，其中光度學參數容易受到成像和染色條件等其它因素的影響，而幾何學參數基本不受影響[7-8]。本研究以物鏡測微尺為研究標定，分別在不同數字攝像頭和生物顯微鏡的成像條件下進行攝像，獲取物鏡測微尺的顯微圖像，采用圖像分析軟件測試每微米所代表的像素值，并對測試結果進行分析比較，探討數字攝像頭和生物顯微鏡對顯微圖像定量分析的影響，為定量分析提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器及軟件

數字攝像頭（DPIXEL200和DP520DC，廣州市泰柯計算機有限公司；MD20，廣州市明美光電技術有限公司；YM310，山東易創電子有限公司；DP26，日本Olympus公司）；生物顯微鏡（CX31和CX41，日本Olympus公司；B204TR和BK-FL4，重慶奧特光學儀器有限責任公司）；顯微鏡攝像接口（U-TV0.5XC-3，U-TV 0.63XC，日本Olympus公司；TV1XC，廣州市明美光電技術有限公司）；物鏡測微尺（日本Olympus公司）；圖像分析軟件（Image-Pro Plus 6.0，美國Media Cybernetics公司）。

1.2 研究方法

以物鏡測微尺為研究標定，分別在不同數字攝像頭和不同生物顯微鏡下攝取測微尺圖像。①不同數字攝像頭組：將數字攝像頭（DPIXEL200、DP520DC、 MD20、YM310和DP26）通過顯微鏡攝像接口安裝在生物顯微鏡（CX31）上，逐一安裝驅動軟件，攝取測微尺的圖像；②不同生物顯微鏡組：將數字攝像頭（DPIXEL200）通過顯微鏡攝像接口安裝在生物顯微鏡（CX31、CX41、B204TR和BK-FL4）上，攝取測微尺的圖像。上述圖像均取4個高倍鏡（40×10）視野，保存于計算機內，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分別測試不同顯微圖像中每微米所代表的像素值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較方法（SNK法）比較不同組間的測試結果，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同數字攝像頭對顯微圖像定量分析的影響

CX31顯微鏡下DPIXEL200、DP520DC、MD20、YM310和DP26攝取的測微尺圖像（圖1）；測試結果顯示，DPIXEL200、DP520DC、MD20、YM310和DP26所攝取的測微尺圖像每微米所代表的像素值分別為（2.398±0.011）、（5.217±0.019）、（4.770±0.012）、（4.764± 0.020）和（4.437±0.023）（圖2）。統計學分析顯示，不同數字攝像頭攝取的測微尺圖像每微米所代表的像素值比較，差異有高度統計學意義（F=15729.14，P=0.001）。

圖1 不同數字攝像頭攝取的測微尺圖像

圖2 不同數字攝像頭組每微米所代表的像素值

2.2 不同生物顯微鏡對顯微圖像定量分析的影響

CX31、CX41、B204TR和BK-FL4生物顯微鏡下DPIXEL200攝取的測微尺圖像（圖3）；測試結果顯示，CX31、CX41、B204TR和BK-FL4生物顯微鏡下DPIXEL200攝取的測微尺圖像每微米所代表的像素值分別為（2.398±0.011）、（2.400±0.009）、（2.409±0.013）和（2.395±0.012）（圖4）。統計學分析顯示，不同生物顯微鏡下DPIXEL200攝取的測微尺圖像每微米所代表的像素值比較，差異無統計學意義（F=1.033，P＞0.05）。

3 討論

形態測試主要體現在對細胞或組織結構特征進行量化分析，以及根據細胞或組織的結構特點，建立定量描述組織結構和細胞形態的概念、參數和測試方法[9-10]。顯微圖像定量分析首先要有研究目標，如細胞涂片、組織切片等標本，然后需要攝取顯微圖像的儀器設備，包含數字攝像頭、生物顯微鏡和計算機，最后就是圖像分析軟件[11-12]，此過程有很多因素可以影響測試結果，如細胞涂片、組織切片的染色濃度和時間、不同規格的數字攝像頭和生物顯微鏡以及攝像軟件的成像條件等[13]，在日常的定量學研究過程中，經常被強調要在同一個數字攝像頭及生物顯微鏡下攝取細胞圖像，才能保證所攝取的顯微圖像具有可比性，但是有些研究需要不同地域的研究機構聯合開展，這時數字攝像頭和生物顯微鏡就不能確保都是同一品牌和型號，這樣攝取的顯微圖像會不會影響研究結果，導致結果出現偏差。為了探討數字攝像頭和生物顯微鏡對顯微圖像定量分析的影響，本研究以物鏡測微尺為研究標定，將不同數字攝像頭安裝同一生物顯微鏡和同一數字攝像頭安裝不同生物顯微鏡后對測微尺進行攝像，應用圖像分析軟件分別測試不同測微尺圖像每微米所代表的像素值，并對測試結果進行分析，結果顯示，同一生物顯微鏡下不同數字攝像頭所攝取的測微尺圖像中每微米所代表的像素值差異有高度統計學意義（P＜0.01），而不同生物顯微鏡下DPIXEL200所攝取的測微尺圖像中每微米所代表的像素值差異沒有統計學意義（P＞0.05），即不同數字攝像頭所攝取的顯微圖像每像素所代表的長度是不一致的，而同一數字攝像頭在不同生物顯微鏡下攝取的顯微圖像每像素所代表的長度是一致的，說明不同數字攝像頭對顯微圖像定量分析有明顯影響，而不同生物顯微鏡則沒有影響，因為數字攝像頭是顯微成像的主要工具，關系到圖像的質量高低，而生物顯微鏡只是將顯微圖像映射到數字攝像頭，并不參與顯微圖像的成像，因此不會影響圖像的質量。因此在顯微圖像定量分析時，如采用不同數字攝像頭進行顯微圖像的采集，就需要分別攝取不同數字攝像頭物鏡測微尺的顯微圖像，然后在圖像分析軟件中進行標定，最后才能進行定量測試，否則容易造成測試結果不準確，而同一數字攝像頭在任何生物顯微鏡下所攝取的顯微圖像，只需標定一次即可進行定量測試。因此研究人員在攝取顯微圖像進行顯微圖像定量分析時，要考慮數字攝像頭的差異所產生的影響，而對于不同生物顯微鏡帶來的差異則可忽略。

圖3 不同生物顯微鏡下DPIXEL200攝取的測微尺圖像

圖4 不同生物顯微鏡組DPIXEL200每微米所代表的像素值

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Effect of digital video camera and biom icroscope on quantitative analysis ofm icroscopic image

CHEN Jinlong1LIJingxiu2LAN Yonghong2
1.Department of Pathogenic biology,Hainan Medical University,Hainan Province,Haikou 571199,China;2.Morphological Laboratory,Hainan Medical University,Hainan Province,Haikou 571199,China

Objective To explore the effect of digital video camera and biomicroscope on quantitative analysis ofmicroscopic image.M ethods The images of objectivemicrometer in different digital video camera(different camera group) and the same digital camera to install different biologicalmicroscope(different biomicroscope group).The representative pixels of permicrometerwere tested by image analysis software,and the test results of two groups were compared and analyzed.Results The pixels representing per micrometer of DPIXEL200,DP520DC,MD20,YM310,DP26 on CX31 microscope were(2.398±0.011),(5.217±0.019),(4.770±0.012),(4.764±0.020),(4.437±0.023)respectively,the differences were high statistically significant(P＜0.01).The pixels representing per micrometer of DPIXEL200 on CX31, CX41,B204TR,BK-FL4 microscope were(2.398±0.011),(2.400±0.009),(2.409±0.013),(2.395±0.012)respectively, and there was no statistically significant difference(P＞0.05).Conclusion Digital video camera has significant influence on quantitative analysis ofmicroscopic image,and biomicroscope has not obvious effect.

Quantitative analysis ofmicroscopic image;Digital video camera;Biomicroscope

Q334

C

1673-7210（2014）01（b）-0160-03

2013-11-22本文編輯：任念）

陳錦龍（1981-），男，碩士研究生，主要從事病原生物學研究工作。

藍永洪（1978-），男，碩士研究生，高級實驗師；研究方向：定量病理學。