1型糖尿病患者外周血調節性T細胞/Th17細胞失衡的臨床意義

賴忠慶

1型糖尿病患者外周血調節性T細胞/Th17細胞失衡的臨床意義

賴忠慶

目的探討CD4+CD25+CD127low/-T細胞及白介素17（IL-17）在1型糖尿病患者外周血中的表達及意義。方法采用三色直接熒光素標記法和多參數流式細胞術檢測16例1型糖尿病患者及18例正常對照外周血CD4+CD25+CD127low/-T細胞的比例，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗方法檢測血清IL-17水平。結果1型糖尿病組外周血CD4+CD25+CD127low/-T細胞比率明顯低于對照組，差異有統計學意義（＜0.05）；1型糖尿病組血清IL-17水平均較正常對照組明顯升高（＜0.05）；1型糖尿病患者外周血CD4+CD25+CD127low/-T細胞與血清IL-17明顯負相關（=－0.619，=0.011）。結論1型糖尿病存在調節性T細胞/Th17細胞失衡，這種失衡或許與1型糖尿病的發病有關。

糖尿病，1型；白介素17；調節性T細胞

1 型糖尿病是一種由T細胞介導的胰島產生細胞損害所引起的自身免疫性疾病。現今的觀點認為有兩種T細胞群與1型糖尿病的疾病發展相關。一種細胞群是調節性T細胞（Treg），可控制自身免疫反應及炎癥細胞，保護發生炎癥的組織阻止有害的免疫反應[1]。另一種細胞群是Th17細胞，與炎癥和自身免疫性疾病的發病相關[2]。包括Th17細胞在內的炎性細胞可被Treg細胞調控。Treg細胞可阻止自身免疫疾病的發生。有很多研究顯示，Treg細胞的減少或功能損害能引起1型糖尿病患者明顯的炎性反應[3-4]。考慮到Treg細胞和Th17的平衡在自身免疫或炎性疾病發病中起到重要作用，本研究探討1型糖尿病患者是否存在該兩種細胞群的失衡。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2012年7月至2014年7月浙江省象山縣第一人民醫院內分泌科收治的16例1型糖尿病住院患者，均為初次診斷（發病在6個月以內），均符合2008年美國糖尿病協會（ADA）的診斷標準[5]。其中男6例，女10例；年齡8～19歲，平均（16.3±4.2）歲；病程1～6個月，平均（3.2±0.5）月。18例正常對照組為同期健康志愿者，其中男8例，女10例；年齡為9～20歲，平均（17.1±4.5）歲。所有患者均資料完整，排除合并感染、酮癥

酸中毒、嚴重器官損害、腫瘤及其它自身免疫疾病的患者。兩組患者一般資料差異均無統計學意義（＞0.05）。

1.2 流式檢測

1.2.1 試劑和儀器FITC標記的鼠抗人CD4抗體(克隆號RPA-T4)、CY標記的鼠抗人CD25抗體(克隆號M-A251)及PE標記的鼠抗人CD127抗體(克隆號Hil-7R-M21)均來自美國BD公司。FOXP3試劑盒（亞型為Rat IgG2a，克隆號PCH101）購自美國eBioscience公司。溶血劑為北京晶美公司FlowCytometry Lysing Solution。流式細胞儀型號為FACsalibur，BD公司產品。

1.2.2 檢測方法受試對象于早晨空腹時采集靜脈血2ml，肝素抗凝，加入CD25-CY、CD4-FITC各10 l及CD127-PE 2 l，混勻后室溫下避光反應15min后加入2ml溶血劑（FlowCytometryLysingSolution），37℃水溶約10min，待完全溶血后，立即上流式細胞儀檢測。每次檢測前常規用熒光微球（FlowCheck）和同型陰性對照試劑對儀器進行質量監測和調控，并用標準方法對各熒光素之間的干擾進行補償，排除相互干擾。檢測時先根據前向角（FSC）和側向角（SSC）散射光信號，對淋巴細胞群進行設門，每次獲取設門內細胞10000個以上并保存數據，然后計算CD25+CD127low/-T細胞占CD4+T細胞的百分比。

1.3 白介素17（IL-17）檢測用肝素鈉抗凝管采集患者及健康對照者早晨空腹時靜脈血2 ml用于血漿IL-17的測定。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定。每個樣本取2ml全血以3000r/min離10min(離心半徑為4cm)，吸出上層血漿置于－20℃冰箱保存，集中測試。嚴格按照說明書步驟進行操作。

1.4 統計學處理采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，采用檢驗；計數資料以率表示，采用2檢驗；相關性分析采用spearman相關分析。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者外周血CD4+CD25+CD127low/-T細胞比率比較1型糖尿病組外周血CD4+CD25+CD127low/-T細胞比率明顯低于對照組，差異有統計學意義（[2.20±0.88）%（3.92±0.64）%，=4.014，＜0.05]。見封三彩圖9。

2.2 兩組患者血清IL-17水平比較1型糖尿病組血清IL-17水平均較正常對照組明顯升高，差異有統計學意義（[18.70±6.98）pg/ml（7.31±2.74）pg/ml，=2.836，＜0.05]。見封三彩圖10。

2.3 1型糖尿病組患者外周血CD4+CD25+CD127low/-T細胞與血清IL-17相關性分析1型糖尿病患者外周血CD4+CD25+CD127low/-T細胞與血清IL-17明顯負相關（=－0.619，=0.011）。見封三彩圖11。

3 討論

1型糖尿病是由多種免疫細胞參與的炎癥反應性疾病。研究表明多種免疫細胞尤其是CD4+T淋巴細胞，包括Thl、Th2、Thl7、Treg等多種細胞亞群在疾病發展過程中發揮不同作用，如Treg維持免疫平衡狀態，Thl7則與炎癥反應有關。

Treg細胞是一群具有重要作用的細胞群，它不僅在維持自身抗原耐受中起主要作用，而且對于維持外周免疫耐受有重要意義[6]。Liu等[7]提出CD4+CD25+CD127low/-T細胞可更好的代表Treg細胞。已有研究指出Treg細胞可有效控制多種炎癥[8]。動物試驗已證實過繼轉移Treg細胞可緩解炎癥，而Treg細胞的減少可加重炎癥反應[9]。

Th17細胞是一個新的TH效應細胞，具有不同的細胞因子和轉錄因子分化特征，可產生其標志性的細胞因子IL-17[10]。已證實IL-17可誘導其它的致炎性細胞因子如IL-6、IL-21、IL-22、趨化因子和急性期蛋白的產生，與多種炎性疾病如類風濕關節炎、銀屑病及炎癥性腸病有關[11]。

Treg細胞與Th17細胞之間的平衡控制著炎癥反應，并與免疫系統的正常功能有關。Treg細胞的減少和/或Th17細胞的增加可誘導炎性反應，進而加速糖尿病并發癥的發生[12]。本研究發現1型糖尿病患者外周血CD4+CD25+CD127low/-T細胞比率明顯降低，而血清IL-17水平較高。這證實了1型糖尿病患者Treg/Th17平衡被打破，可能與1型糖尿病的發病存在一定的關系。同時筆者發現1型糖尿病患者外周血CD4+CD25+CD127low/-T細胞與血清IL-17明顯程負相關。這提示了1型糖尿病可能存在IL-17的抑制障礙。筆者認為1型糖尿病患者Treg細胞的減少導致了Th17細胞的失控。

目前，1型糖尿病并無有效的治療可以直接針對抗體，從而阻止胰島細胞的進行性破壞，考慮到Treg細胞的減少參與了1型糖尿病患者體內的免疫反應異常，故應該更深入的研究Treg/Th17的分化以及調控機制。增加Treg細胞和/或減少IL-17或許對1型糖尿病的治療將有重大的意義。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2014.11.032

R587.1

A

1671-0800(2014)11-1386-03

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