VD3羥基化酶的定向研究進展

VD3羥基化酶的定向研究進展

劉苗 汪永輝 陸群
（西南交通大學生命科學與工程學院，成都 610031）

維生素 D3羥基化酶（Vdh）作為細胞色素酶P450s（CYP）蛋白家族成員，催化VD3形成有生物活性的1α，25（OH）2VD3。但是，由于VD3并不是Vdh的天然底物，Vdh羥基化活性較低。采用定向構建Vdh重組質粒的方法對Vdh催化活性位點給予優化，從而提高其羥基化能力。就目前對Vdh的結構特性和定向研究進行綜述。

Vdh 異源表達 氧化還原蛋白 定向突變 25（OH）VD31α，25（OH）2VD3

VD3是一種脂溶性的激素原，它主要是經紫外線照射從皮膚內的7-脫氫膽固醇轉化而來，或是從食物當中獲取［1，2］。在哺乳動物中，VD3沒有生物活性，因此必須利用細胞色素酶P450s（CYPs）對VD3進行羥基化，轉化成有生物活性形式的VD3，即25-OHVD3，1α，25-（OH）2VD3。在人體內，首先是由肝臟中的CYP27A1催化形成25-OHVD3，然后再由腎臟中的CYP2R1催化形成1α，25-（OH）2VD3，通過這兩步反應完成了VD3-1α，25（OH）2VD3的轉化過程。活性1α，25（OH）2VD3在體內與維生素D受體結合（VDH）可以調節鈣磷代謝，以及調控多種細胞應答，如細胞分化和細胞增殖等。1α，25（OH）2VD3及其衍生物在臨床上已經被用于治療慢性腎功能衰竭、甲狀旁腺功能亢進、骨質疏松以及銀屑病等疾?。?，4］。雖然從膽固醇到1α，25-（OH）2VD3的化學合成路線已經成熟，但是其總產率卻不到1%。工業上，一般采用生物合成的方法，只需要一步就能實現VD3的轉化過程，且成本低，對環境的污染小。而實現這種生物催化反應，關鍵在于反應所使用的微生物菌株以及VD3羥基化酶（Vdh）的手性和特異性結構域［2］。

大多數的細菌、真菌及放線菌如假諾卡氏菌屬自養菌株，鏈霉菌屬等微生物都能將無生物活性VD3轉化成有生物活性的1α，25（OH）2VD3［2］。在工業上一般采用環糊精作為底物載體，但是運用這種方法酶的轉化能力較弱，且副反應多，轉化菌株的生長速度低。因此為了提高Vdh的反應活性，有必要對VD3羥基化酶的特性以及定向研究進行概述和分析。

Vdh屬于CYP107蛋白家族成員。CYP107酶是一個超家族，其共同特點是含有一非共價鍵結合的血紅素，是一個內膜蛋白，牢固地結合在細胞內膜

上，需要NADPH的還原等價物和氧分子來氧化底物，NADPH提供的電子需要氧化還原伴侶蛋白將其傳遞到細胞色素酶P450酶上。天然的P450s大多為脂溶性的，其在細胞內的表達水平比較低，不利于工業化生產。為了擴大P450s的應用以及增加其利用度，因此有必要提高P450s包括底物作用域、區域選擇和立體選擇性、催化活性、抑制作用及聯合表達等在內的催化活性。

1 vdh異源細胞表達

由于游離的Vdh活性不高，結構不穩定，體外反應常表現出廣譜底物活性。所以研究者一般采用異源表達系統即宿主-載體系統表達Vdh基因（vdh）。大腸桿菌、酵母等作為宿主系統具有生長快，容易操作等優點。放線菌基因組中含有許多P450酶的基因，具有穩定的氧化還原反應環境。因此放線菌如鏈霉菌、假諾卡氏菌、紅平紅球菌等均可作為良好的Vdh宿主菌株。Sakaki等［5］成功利用大腸桿菌（E.coli）表達小鼠25（OH）VD31α-羥基化酶。Kawauchi等［6］從自養無枝酸菌桿菌FEM BP-1573中分離出P450VD25（CYP105A2），成功地在變鉛鏈霉菌（S.lividans）中表達。Fujii等［2］以放線菌屬紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis）為宿主細胞建立了CYP107（Vdh）的表達系統，使CYP107的羥基化能力特異性增強。酵母細胞表達系統能識別線粒體和微粒體P450酶的靶向信號序列。由此相關學者從人類細胞組織中分離出CYP2R1基因，轉入大腸桿菌或釀酒酵母菌（S.cerevisiae）中表達，其CYP2R1的表達水平顯著增加。該研究發現重組的酵母細胞具有單氧合酶的活性，能在細胞溶質和細胞膜上形成電子傳遞鏈［7］。刪除人CYP2R1（維生素D325-羥基化酶）與老鼠CYP2J3（維生素D325-羥基化酶）疏水性區域的氨基酸殘基后，導入大腸桿菌中表達，25（OH）VD31α羥基化活性特異性增加。重組的酵母細胞功能性地表達人CYP2R1，加入底物后，能將VD3催化形成25（OH）VD3［8，9］。不同的Vdh在不同的異源表達系統表達水平不同。因此表達不同的vdh時應選擇合適的宿主細菌。合適的異源細胞表達系統不僅能實現維生素D3的羥基化過程，還能合成新的代謝產物，并且在野生型和突變型羥基化酶的對比研究中發揮中至關重要的作用［9］。圖1和圖2分別為各種細菌和哺乳動物中VD325-和25（OH）VD31α-羥基化酶以及它們的異源表達系統。

表1 VD325-羥基化酶及其異源表達系統［1-9］

表2 25（OH）VD31α-羥基化酶及其異源表達系統［6-9］

2 Vdh與氧化還原伴侶蛋白協同表達

大多數天然的Vdh如果單一的在宿主細胞中表達，那么它的羥基化能力較弱。因此，Vdh在宿主細胞表達的同時需要氧化還原蛋白作為分子伴侶協同表達，提高酶表達量。常用的分子伴侶為鐵氧還原蛋白，如ThcD、AciC、Fdx、Fdr和AciB等［2，10］。Vdh是一類微粒體P450酶，能夠接受NADPH-細胞色素P450s 還原酶提供的電子。鐵氧還原蛋白酶將NADH供體提供的電子轉移到Vdh的血紅素結構域。Fujii等［2］發現Vdh基因若單獨在宿主細胞當中表達，VD3的C-25位羥基化活性較低（20.2 mmol/ min/mol），然而氧化還原伴侶蛋白ThcC/ThcD-VDh重組基因在宿主細胞當中聯合表達后，Vdh的C-25的羥基化活性增加了近6倍（119.2 mmol/min/mol）。這些數據說明盡管內源性的氧化還原分子同時在宿主細胞當中表達，Vdh-氧化還原伴侶蛋白的聯合表達也能增強該酶的羥基化活性。Sawada等［11］成功地構建了人的CYP27B1和牛的ADX，ADR的表達質粒，然后導入大腸桿菌細胞中表達。CYP27B1羥基化活性特異性增加。這就說明了電子通過ADX和ADR

從NADPH成功地轉移到了CYP27B1，形成電子傳遞鏈。Strushkevish等［12］發現人類CYP2R1與分子伴侶蛋白GroEL/ES在大腸桿菌中協同表達，發酵培養物中25（OH）VD3，1α，25-（OH）2VD3的產量顯著增加［12］。CYP27B1是25（OH）VD3的1α羥基化酶，催化1α，25-（OH）2VD3的形成。Uchidaa等［13］將小鼠體內的CYP271-GroEL/ES重組基因導入到大腸桿菌中過量表達，CYP27B1的表達水平遠高于野生型。而缺少GroEL/ES分子伴侶蛋白時，CYP27B1酶的結構發生折疊導致表達水平降低。放線菌類菌株含有穩定的Vdh，并且具有電子轉移蛋白酶，提供了氧化還原反應的環境。因此，放線菌常用來作為工業上進行羥基化反應的宿主菌株。目前將氧化還原蛋白融合到Vdh的表達質粒中協同表達是提高Vdh的25-和1α-羥基化活性一種有效的基因重組方法。

3 誘導表達重組質粒

構建Vdh表達質粒的試驗中，研究者發現構建的重組質粒在大腸桿菌（E.coli）/鏈霉菌（Streptomyces）中的表達水平較低，因此他們在試驗過程中加入誘導劑誘導重組質粒的表達，提高Vdh的表達水平。常用的誘導劑為丙酮、硫鏈絲菌素等。Fujii等［14］構建了PTAOR3-VDh-boxAB重組質粒，導入到P. autotrophica中表達，細胞提取物利用SDS-PAGE和CO差譜分析法（CDSA）測定其Vdh的活性。分析發現在加入丙酮的細胞提取物中，CDSA在P450 nm處有顯著的吸收峰，而沒有加入丙酮的細胞提取物中，CDSA在P450 nm處沒有明顯的吸收峰。SDSPAGE數據也顯示丙酮能誘導PTAOR3-VDh-boxAB的表達。分析結果表明丙酮能作為誘導劑誘導分子伴侶蛋白boxAB和VDh 活性的表達。同樣地，相關學者在構建VDh-Fdx-Fdr的表達基因的同時，采用硫鏈絲菌素作為誘導劑誘導重組質粒在紅平紅球菌中表達。結果在紅平紅球菌的培養中檢測到大量的VD3的活性形式［15］。這些數據說明宿主細胞在表達Vdh和氧化還原伴侶蛋白的重組基因時，都需要加入誘導劑誘導其表達。

4 定向構建Vdh的突變體

由于VD3并不是Vdh的天然底物，所以研究者們采用定向誘變Vdh基因，改變底物識別域的結合位點來獲得更高酶活性的Vdh［16］。Fujii等［2］先從假諾卡氏屬自養無枝酸菌 NPRC12473分離得到Vdh基因，經隨機突變，將其突變基因克隆到載體PET-aciBC上，然后轉入大腸桿菌中表達，從1 000個轉化物中分離得到8個高活性突變體，得到4個最佳氨基酸置換，構建出Vdh-K1的突變體。同樣地，定點突變也檢測到了這個8個活性位點。在這8個活性位點中，Fujii分析出4個最佳氨基酸置換點（T70R，V156S，E216A，E384R）。相對于野生型基因表達活性而言，其中每一個突變體在大腸桿菌中Vdh表達活性都提高了2-3倍。這4個突變基因同時在大腸桿菌中表達，Vdh的羥基化的活性會提高7.9倍。Fujii將這4個最佳的基因置換組合整合到前面所得到的Vdh-K1的突變菌株中表達，得到光譜數據顯示Vdh 25-羥基化的活性提高12倍，25（OH）VD3的1α-羥基化活性提高近22倍（相對于野生型Vdh-WT）［1，2，16］。文獻報道在Vdh-K1的培養物中，科學家們不僅發現25（OH）VD3，1α，25（OH）2VD3的含量明顯增加，還檢測到少量的26（OH）VD3，但并沒有檢測到1α（OH）VD3分子［1，17，18］。晶體結構分析［1］表明Vdh-K1的4個氨基酸替換不是位于酶的底物結合位點上，而是在酶結構呈分散排列。不管有無底物的結合，突變型Vdh-K1呈封閉的分子構象，末端的血紅素囊狀結構暴露在溶劑中；野生型Vdh-WT卻呈現開放式的分子構象。這些結果表明通過4個氨基酸替換（T70R、V156S、E216A和E384R）使得Vdh分子構象平衡從開放式向封閉式構象移動［1］。Hayashi等［19］通過對細胞色素酶P450（CYP）105A1基因定向誘變，獲得R73V/R84V雙突變體，該突變體能實現VD3-1α，25（OH）2VD3過程的高轉化。突變點R73V/R84V位于CYP105A1基因中底物識別域上，具有25（OH）VD31α-高羥基化能力［16］。他們在變鉛青鏈霉菌TK23進行重組表達，并且在該鏈霉菌的培養物當檢測到大量的1α，25（OH）2VD3，除此之外，還檢測到新的代謝產物1α，25（R），26（OH）3D3和1α，25（S），26（OH）3D3

［16，20］。這兩種新的代謝產物同樣也具有抗增殖活性和低血鈣活性，但二者的轉化率不高。通過晶體結構分析和Docking 軟件模擬底物結合方法，

Hayashi等［19］證實了R73V/R84A突變體具有VD3C25，C1和C26（C27）的羥基化的能力。從淺灰鏈霉菌中提取出的P450酶系CYP105A1具有VD2和VD3的羥基化能力。Omer等［20］通過在CYP105A1（P450SU-1）N端添加靶向信號序列，成功地將其導入到高等植物中的葉綠體中表達。Sawada等［21］成功地將淺灰鏈霉菌的CUP105A1重組基因導入到大腸桿菌中表達，提高了VD3 25-和25（OH）VD3 1α-羥基化活性。Seifert等［22，23］針對CYP102A1催化位點上F87和A328兩個氨基酸殘基進行定點突變，獲得24種新的突變體。這些系列突變體能識別多種底物，產生廣泛而有效的環化和非環化的羥基化合物。

經過定向誘變，獲得高活性Vdh突變體，突變體不僅具有更高酶的活性，并且對反應活性位點具有高度選擇性。新的穩定構象通常具有不同的功能特異性，因而產生不同的區域選擇和立體選擇性，識別不同的VD3底物分子，得到新的具有抗增殖，低血鈣等生物學功能的VD3活性藥物。為臨床上治療維生素D類疾病提供有效的途徑。

5 展望

為了提高Vdh羥基化能力，研究人員采取異源表達系統表達vdh，協同表達氧化還原分子伴侶蛋白提高Vdh重組質粒的表達水平，加入誘導劑或啟動子啟動重組質粒的表達，定點突變Vdh活性位點提高酶的羥基化能力。除此之外，在表達Vdh基因同時，有相關學者［10，19］采用添加抗生素例如乳鏈球菌素（nisin）等方法形成乳鏈球菌素-脂質微孔復合物，形成VD3-PMCD復合物的離子通道，提高Vdh的羥基化活性。除了上述方法外，VD3-PMCD復合物進入細胞機制的研究，以及Vdh-底物晶體結構分析，相應靶向信號蛋白序列的添加或抑制酶活性的氨基酸殘基的刪除，Vdh的區域和立體選擇性和有序羥基化反應的分子機制的研究等蛋白工程方面都是未來獲取更高酶活性Vdh的研究重點，為 Vdh的定向研究提供新的方向和前景。相信隨著生物技術的快速發展，活性維生素D3藥物的生物制備將會得到新的突破。

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（責任編輯 狄艷紅）

Advances in Directed Research of VD3Hydroxylase

Liu Miao Wang Yonghui Lu Qun
（School of Life Science and Engineering of Southwest Jiaotong Uiversity，Chengdu 610031）

Vitamin D3 hydroxylase is a cytochrome P450（CYP）responsible for the biocatalytic conversion of vitamin D3 to 1α, 25-dihydroxyvitamin D3（1α, 25（OH）2VD3）。Since VD3 is not a natural substrate for Vdh, the hydroxylase of Vdh is quite low. Researchers construct a novel of recombination Vdh plasmid by directed evolution to optimize the active sites of catalytic structure, thereby improving the hydroxylase ability. This article reviewed Vdh structure properties and development of directed evolution.

Vdh Heterologous expression Redox partner protein Directed evolution 25-hydroxyvitaminD3 1α 25-dihyroxyvitamin D3

2013-08-09

劉苗，女，碩士研究生，研究方向：生物轉化；E-mail：920946828@qq.com

陸群，男，副教授，碩士生導師，研究方向：微生物藥學、生物催化與降解、反應器與生化工藝學原理；E-mail：luqun1125@126.com