NF-κB 信號通路在魚類先天性免疫中的作用

NF-κB 信號通路在魚類先天性免疫中的作用

楊冰貞 張民 王克堅(jiān)
（廈門大學(xué) 近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361102）

NF-κB（nuclear factor κB）是一種廣泛存在的核轉(zhuǎn)錄因子。經(jīng)不同刺激信號激活后，參與多種免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，對魚類先天性免疫調(diào)節(jié)起著十分重要的作用。對魚類NF-κB的結(jié)構(gòu)、功能及其信號傳導(dǎo)途徑進(jìn)行概述，并對NF-κB信號通路在魚類先天性免疫調(diào)節(jié)中的作用進(jìn)行綜述。

NF-κB信號通路 魚類 先天性免疫

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的重要調(diào)節(jié)蛋白，是免疫系統(tǒng)機(jī)制的活化劑［1］，在Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）識別病原相關(guān)分子模式后，通過依賴MyD88或TRIF信號傳導(dǎo)通路，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被誘導(dǎo)激活，從而啟動固有免疫和適應(yīng)性免疫而抵御病原的入侵。許多研究表明，它可以被細(xì)胞因子（如TNF、IL-1）、細(xì)菌、病毒、免疫刺激劑等多種刺激物及紫外線所激活。

魚類兼具先天性與獲得性免疫，但獲得性免疫應(yīng)答效率低且發(fā)生相對滯后，因此先天性免疫在魚類免疫防御反應(yīng)中起著重要的作用。對魚類先天性免疫調(diào)控機(jī)制研究逐漸成為熱點(diǎn)。魚類NF-κB調(diào)控研究尚處于初級階段，其信號通路中的免疫相關(guān)基因及具體的調(diào)控機(jī)制研究尚不深入。免疫系統(tǒng)識別抗原并通過NF-κB傳遞信息，使得這個可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子受到越來越廣泛的關(guān)注。

1 NF-κB家族

NF-κB是一種從昆蟲到人類，進(jìn)化上保守的核轉(zhuǎn)錄因子［2］。在許多物種中都發(fā)現(xiàn)了NF-κB活化的信號通路和NF-κB介導(dǎo)的免疫功能。哺乳動物中已經(jīng)鑒定了NF-κB家族5個成員：RelA、RelB、c-Rel、p105/p50（NF-κB1）和p100/p52（NF-κB2）［3］。非洲爪蟾也已報道有NF-κB1、p65、RelB和c-rel基因的存在［4-7］。在哺乳動物中已經(jīng)證明NF-κB對免疫和炎癥反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用［8］。而果蠅的Dorsal，Dif和Relish在調(diào)節(jié)不同類型的抗菌肽基因的表達(dá)方面也起著關(guān)鍵的作用［9］。近年來，魚類免疫防御相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的研究越來越受關(guān)注。已從鱖魚（Siniperca chuatsi），河豚（Takifugu rubripes），淡水青鳉魚（Oryzias latipes），牙鲆（Paralichthys olivaceus）以及金眼門齒鯛（Stenotomus chrysops）等魚類中被分離出NF-κB家族成員。斑馬魚（Danio

rerio）中鑒別出p65，p100/p52，RelB，c-Rel和p50五個家族成員。且斑馬魚NF-κB/IκB蛋白序列分析表明與哺乳動物具有高度相似性，體現(xiàn)了NF-κB家族在進(jìn)化上的保守性［10］。

NF-κB家族蛋白N端都含一個高度保守RHD結(jié)構(gòu)域（Rel-homology domain），與蛋白的二聚化、DNA結(jié)合以及與抑制蛋白IκB相作用等功能有關(guān)。RelA、RelB和c-Rel則在C端有轉(zhuǎn)錄激活域（Transactivation domain，TAD）， 而 NF-κB1和 NF-κB2沒有［11］。鱖魚p65/IκBα序列比對發(fā)現(xiàn)它們與其他脊椎動物具有相似的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)，蛋白模型分析也發(fā)現(xiàn)與人類的相應(yīng)蛋白有相同的折疊結(jié)構(gòu)［12］。NF-κB通過二聚化形成同源或異源二聚體來對不同刺激進(jìn)行特異性應(yīng)答，可誘導(dǎo)的形式是異源二聚體。其中p50/p65異源二聚體具有最普遍的NF-κB結(jié)合活性［13］。

2 魚類中受NF-κB調(diào)控的靶基因

NF-κB調(diào)控著病原應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中許多位點(diǎn)上誘導(dǎo)物和效應(yīng)物的表達(dá)。許多基因的啟動子序列或增強(qiáng)子序列上都能識別到NF-κB響應(yīng)的位點(diǎn)（κB結(jié)合位點(diǎn)）（表1），表明NF-κB是一種多效性的轉(zhuǎn)錄因子。這些基因包括免疫和炎癥密切相關(guān)的細(xì)胞因子、急性相響應(yīng)蛋白、細(xì)胞黏附蛋白［14，15］和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶等效應(yīng)分子。近年來在魚類研究中發(fā)現(xiàn)抗菌肽hepcidin和β-defensin也受到NF-κB的調(diào)控影響。且研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB的誘導(dǎo)激活能夠增強(qiáng)免疫應(yīng)答。從表1所列的κB位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)在不同物種和基因中NF-κB結(jié)合位點(diǎn)有所差別，這種差別導(dǎo)致了與NF-κB結(jié)合時有不同的親和力，從而特異性調(diào)控基因表達(dá)。

表 1 啟動子區(qū)含NF-κB結(jié)合序列的免疫相關(guān)基因

在目前報道的魚類研究中，受到NF-κB調(diào)控的靶基因主要包括以下幾個方面：

（1）細(xì)胞因子、促炎癥因子。NF-κB通路是先天免疫系統(tǒng)中細(xì)胞信號通路激活的核心［16］。在先天性免疫應(yīng)答中，宿主首先釋放細(xì)胞因子和其他調(diào)節(jié)因子防御病原體的入侵。魚類NF-κB通過對IL-6、IL1β［17］、IL-12［18］和TNFα等基因的表達(dá)調(diào)節(jié)，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮功能。（2）急性反應(yīng)蛋白。如血清淀粉樣蛋白A（Serum amyloid A，SAA）［19］、Mx1［20，21］、C9、抗菌肽hepcidin，防御素β-defensin等。NF-κB對急性蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)是應(yīng)激的一種重要變化，具有廣泛的免疫防御意義。（3）細(xì)胞表面受體：Toll樣受體如TLR5等［22，23］。

特定基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)往往是需要多個轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用的。NF-κB并不是調(diào)節(jié)靶基因的唯一轉(zhuǎn)錄因子，它還能與其他的轉(zhuǎn)錄因子如活化蛋白-1（AP-1）共同起著調(diào)節(jié)作用［24］。許多轉(zhuǎn)錄因子啟動子序列中也發(fā)現(xiàn)了NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，由此NF-κB可活化其他轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。

3 NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

3.1 NF-κB的激活機(jī)制

已發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路存在于各物種中，且非常保守［25］。其激活機(jī)制主要依賴于IκB蛋白磷酸化所誘導(dǎo)的泛素化蛋白的水解作用。胞質(zhì)中NF-κB與IκB蛋白相結(jié)合而處于非活性狀態(tài)。當(dāng)胞外刺激通過細(xì)胞膜上的模式識別受體激活蛋白激酶，引起IκB發(fā)生磷酸化而與NF-κB解離。游離IκB在泛素化蛋白的作用下被降解，NF-κB二聚體因其NLS的暴露被迅速介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核，與免疫調(diào)節(jié)基因的特異序列結(jié)合介導(dǎo)各種細(xì)胞因子和共刺激因子的表達(dá)。

3.2 NF-κB的抑制蛋白IκB

IκB家族蛋白包括IκBα，IκBβ，κBγ，IκBε和

Bcl-3。IκB蛋白的特征是含有5-7個錨定蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)ANKs。這些錨定蛋白重復(fù)序列和NF-κB的Rel同源結(jié)構(gòu)域相互作用，覆蓋了NF-κB上的核定位序列（Nuclear localization sequence，NLS）， 使NF-κB滯留于細(xì)胞質(zhì)中。其中對IκBα的研究最多，認(rèn)為其在抑制NF-κB中起主要作用。

與高等脊椎動物和果蠅相比，對魚類IκBα蛋白的研究報道為數(shù)甚少［26-28］。盡管在一些魚類中已鑒定出了IκBα樣基因序列，但是也僅限于對虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、斑馬魚、牙鲆和鱖魚的研究，且大多止于轉(zhuǎn)錄水平的研究，少有功能研究［10，27-29］。在免疫信號通路中，NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性往往受到嚴(yán)格調(diào)控，因?yàn)檫^度的激活會對宿主造成損傷，因而需要負(fù)調(diào)節(jié)方式來保證信號傳導(dǎo)的平衡。而細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中蛋白IκB的調(diào)節(jié)是阻止NF-κB激活的機(jī)制之一［30］。已報道斑馬魚NF-κB能與哺乳動物IκBα發(fā)生結(jié)合作用，且在LPS的刺激下，顯性抑制蛋白IκB的過表達(dá)阻斷了NF-κB活性。Zhang等［31］研究表明在舌鰨（Cynoglossus semilaevis）中存在受IκBα負(fù)反饋調(diào)節(jié)的NF-κB-IκBα途徑。而Wang等［28］則采用免疫共沉淀法研究了鱖魚p65與IκBα的結(jié)合作用，同時發(fā)現(xiàn)IκBα基因上游調(diào)控區(qū)包含NF-κB結(jié)合位點(diǎn) 。這表明NF-κB可使IκBα基因表達(dá)上調(diào)，新合成的IκBα又抑制了NF-κB活性。從而，IκBα通過一個自身的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制保證了NF-κB活性的關(guān)閉，以維持細(xì)胞的穩(wěn)定性。

3.3 Toll樣受體介導(dǎo)的NF-κB激活

Toll-NF-κB途徑是機(jī)體免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵信號通路。Toll樣受體是位于細(xì)胞表面的模式識別受體，其介導(dǎo)激活的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號途徑可特異性對各種病原體作出應(yīng)答。不同病原體激活NF-κB信號通路往往涉及不同的支架蛋白和信號蛋白。許多脊椎動物有不止一種TLR的報道［32］，目前在魚類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了19種TLR［33］。其中魚類特有的TLR基因（如TLR21、TLR22和TLR23）是在進(jìn)化過程中保留下來的重要基因，具有重要研究價值。在哺乳動物中，膜結(jié)合的TLR5識別細(xì)菌的鞭毛蛋白成分，并通過MyD88途徑激活鞭毛介導(dǎo)的NF-κB。然而，與哺乳類僅存在單一受體系統(tǒng)不同，虹鱒的細(xì)菌鞭毛識別可通過膜型和可溶型TLR5兩種受體。體外試驗(yàn)表明，TLR5S基因能夠識別鞭毛并且能輔助增強(qiáng)人TLR5所介導(dǎo)的NF-κB活性［34］。溝鯰（Ictalurus punctatus）中只發(fā)現(xiàn)了TLR3和TLR5的部分序列，研究顯示純系溝鯰和雜交品系溝鯰［Back-cross hybrid Catfish、F1 male（blue×channel）× female channel catfish］在感染愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）后都具有上調(diào)表達(dá)［35，36］，暗示了它們參與細(xì)菌導(dǎo)致的急性感染反應(yīng)。文昌魚（Branchiostoma belcheri）TLR3能特異性識別病毒復(fù)制的中間產(chǎn)物dsRNA，進(jìn)而激活NF-κB和干擾素IFNβ前體。抗TLR3單克隆抗體對成纖維細(xì)胞IFNβ的產(chǎn)生起到抑制作用［37］。

哺乳動物TLRs下游信號涉及接頭蛋白（MyD88、SARM、MAL、TRAM和TRIF），NF-κB的 激 活，INK及IFN信號通路［38］。2004年在斑馬魚基因組中發(fā)現(xiàn)了MyD88，MAL，SARM和TICAM接頭蛋白［39］，但沒有發(fā)現(xiàn)TRAM蛋白，表明魚類TLRs下游可能存在有別于哺乳動物的信號通路。

MyD88能夠被除TLR3之外的所有TLR成員募集，并觸發(fā)NF-κB信號通路和絲裂素活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）［40，41］。研究表明，斑馬魚TLRs能夠通過募集MyD88接頭蛋白活化NF-κB通路以及MAPK通路使細(xì)胞釋放TNFα等促炎因子［42］。遲鈍愛德華菌刺激試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牙鲆腎臟中出現(xiàn)膿腫，且膿腫周圍大量表達(dá)MyD88基因［43］，表明遲鈍愛德華菌對牙鲆的炎癥誘發(fā)是一條MyD88依賴信號通路。Skjaeveland等［44］將大西洋鮭（Salmo salar）MyD88導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞后，經(jīng)CpGODN刺激能激活NF-κB的表達(dá)。

TRIF只能被TLR3和TLR4募集，并且活化NF-κB信號通路和轉(zhuǎn)錄因子IRF3。魚類TRIF介導(dǎo)TLR3和TLR22的信號傳導(dǎo)，激活NF-κB進(jìn)而產(chǎn)生IFN，但有研究發(fā)現(xiàn)魚類TRIF不激活I(lǐng)RF3［45，46］。但在紅鰭東方鲀研究中，TLR22能夠激活TRIF依賴型信號通路而磷酸化轉(zhuǎn)錄因子IRF3，使其活化入核誘導(dǎo)I型干擾素的釋放［47］。斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）的研究中也表明該通路的激活［48］。此外斑馬魚TRIF與RIP1相互作用，活化NF-κB，而不能通過TRAF6［49］。由此發(fā)現(xiàn)魚類TRIF在這一功能上

與哺乳動物有所不同。

TIRAP/Mal和TICAM/TRAM則分別作為MyD88和TRIF的輔助接頭蛋白。TIRAP/Ma輔助MyD88募集到細(xì)胞表面TLR2以及TLR4上［50］。而TICAM2/ TRAM則輔助TRIF募集到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)TLR4上［51］。

4 魚類NF-κB先天性免疫應(yīng)答

昆蟲先天性免疫應(yīng)答主要通過激活Toll和Imd兩條信號途徑，經(jīng)由NF-κB調(diào)控抗菌活性物質(zhì)的表達(dá)。已有研究表明，NF-κB信號通路通過調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達(dá)在魚類先天性免疫中發(fā)揮著重要的作用。例如，錐漿蟲的感染下，鯉魚（Cyprinus carpio）NF-κB能夠誘導(dǎo)炎癥因子TNFα和IL1β表達(dá)而產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)［52］。創(chuàng)傷弧菌刺激96 h，口服抗菌肽epinecidin-1重組蛋白的鯰魚（Silurus asotus）和斑馬魚增強(qiáng)了TLR4，IL1β 及NF-κB等基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)了抗菌能力，使感染死亡率下降［53］。在另一些研究中發(fā)現(xiàn)，熱滅活的大腸桿菌、PGN、LAT也可以激活NF-κB。這說明了NF-κB對多種細(xì)菌的刺激產(chǎn)生了免疫應(yīng)答。目前NF-κB抗菌免疫的研究較少，且集中于對炎癥因子的表達(dá)調(diào)控。但如前文提及，在魚類的許多抗菌分子啟動子區(qū)上都已發(fā)現(xiàn)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，從而進(jìn)一步提示了NF-κB一方面誘導(dǎo)抗菌物質(zhì)的合成，直接殺傷病原微生物；另一方面誘導(dǎo)炎癥因子等引發(fā)免疫反應(yīng)有效抵抗病原微生物的入侵。

Wang等［28，54］發(fā)現(xiàn)在ISKNV病毒或鯉春病毒血癥病毒感染下，NF-κB抑制劑IκBα mRNA表達(dá)量顯著下降，表明NF-κB/IκB信號通路參與了病毒感染過程。且傳染性胰臟壞死病毒（IPNV）感染斑馬魚胚胎細(xì)胞時，TNFα、Mx、IL1β及mmp等免疫相關(guān)基因與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達(dá)量均發(fā)生上調(diào)，而利用NF-κB特異性抑制劑阻斷NF-κB激活通路后，免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平被抑制下調(diào)，感染期間，TNFα依賴的NF-κB信號通路參與細(xì)胞因子和金屬蛋白酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［55］。del Castillo等［56］在紅鰭東方鲀中鑒別出了兩個dsRNA依賴的PKR亞基（蛋白激酶R），在病毒感染過程中表達(dá)均上調(diào)，揭示其具有抗病毒功能。而PKR的上調(diào)由IFN-γ激活引起，通過熒光素酶試驗(yàn)也表明PKR能夠激活NF-κB而發(fā)揮抗病毒作用。

在抵抗RNA病毒感染的先天免疫中，主要的兩類PRRs分別是TLRs、RLRs。TLR依賴的信號通路主要通過激活了NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，從而誘導(dǎo)抗病毒干擾素的產(chǎn)生。而RLR介導(dǎo)的抗病毒免疫信號中，重要接頭MAVS/IPS-1也能激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，最終誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生。I型干擾素的產(chǎn)生是抗病毒免疫反應(yīng)中最重要一個方面。大西洋鮭中發(fā)現(xiàn)的與哺乳動物IFNβ相似的IFNα1 和IFNα2，經(jīng)啟動子序列分析表明病毒對干擾素激活依賴于IRF-3和NF-κB，且NF-κB特異性抑制劑PDTC對Poly I∶C誘導(dǎo)的IFNα啟動子活性的抑制達(dá)90%［57，58］。以上的研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB主要通過調(diào)控干擾素反應(yīng)系統(tǒng)或直接誘導(dǎo)抗病毒活性相關(guān)蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抗病毒感染作用。因而目前魚類中NF-κB的激活更多認(rèn)為是對宿主抵抗病毒病原體的一種保護(hù)性反應(yīng)。但研究發(fā)現(xiàn)IPNV感染誘導(dǎo)NF-κB的激活，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡［59］。且哺乳動物研究中發(fā)現(xiàn)病毒能夠直接激活NF-κB而抑制凋亡，通過提高宿主細(xì)胞的存活能力以延長病毒復(fù)制、繁衍后代的時間。可見，NF-κB與病毒之間可能存在復(fù)雜和緊密關(guān)系，因而有必要進(jìn)一步研究魚類NF-κB信號通路對宿主細(xì)胞或病毒所發(fā)揮的作用。

5 結(jié)語

綜上所述，TLR-NF-κB信號通路保守，在魚類先天性免疫應(yīng)答中同樣也能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。作為經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，NF-κB在哺乳動物中調(diào)控作用研究的比較清楚。目前雖已在魚類許多免疫基因啟動子序列中識別出NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，但對魚類NF-κB調(diào)控作用及機(jī)制的研究仍較少。因而，深入研究NF-κB調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，闡明其在魚類中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，將有利于進(jìn)一步闡明魚類對病原刺激的免疫應(yīng)答機(jī)制，可以為深入了解魚類的先天性免疫機(jī)制奠定重要的基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)有目的地調(diào)控NF-κB信號通路，將為有效增強(qiáng)魚類抗病能力提供重要的理論指導(dǎo)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Role of NF-κB Signal Pathway in the Innate Immune System of Fish

Yang Bingzhen Zhang Min Wang Kejian
（State Key Laboratory of Marine Environmental Science，Xiamen University，Xiamen 361102）

NF-κB（Nuclear factor κB）as an ubiquitously expressed nuclear transcription factor, involves in regulating the expression of immune-related genes after activation by a variety of stimuli and thus plays a very important role in the innate immune system of fish. It reviewed the structure, function and the signal pathway of fish NF-κB. Furthermore, we reviewed the role of NF-κB signal pathway in the innate immune system in fish.

NF-κB signal pathway Fish Innate immune system

2013-09-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41276102），教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計劃”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（IRT0941）

楊冰貞，女，碩士研究生，研究方向：海洋分子生物學(xué)與免疫毒理學(xué)；E-mail：bingzhenyang2009@126.com

王克堅(jiān)，男，博士，教授，研究方向：海洋分子生物學(xué)與免疫毒理學(xué)；E-mail：wkjian@xmu.edu.cn