響應面分析法優化乙酸乙酯萃取番茄紅素條件的研究

響應面分析法優化乙酸乙酯萃取番茄紅素條件的研究

沈海濤 王愛英 祝建波
（石河子大學生命科學學院 石河子大學農業生物技術重點實驗室，石河子 832003）

采用響應面方法對番茄醬提取番茄紅素過程中的乙醇預處理方法、萃取劑萃取時間等工藝條件進行了優化。采用Central Composite Design（CCD）設計法，對超聲波提取法和微波提取法中的乙醇預處理、萃取劑萃取時間、超聲波或微波萃取功率、溶劑量4個因素對番茄紅素提取率的影響進行評價。結果顯示，最佳提取方法為超聲波提取法，無水乙醇∶番茄醬的2.05∶1（V / W）；乙酸乙酯∶番茄醬10.1∶1（V / W）；提取時間為490 s；超聲波提取功率為405 W；提取率為94.42%。微波提取最佳方法為，無水乙醇∶番茄醬的2.11∶1（V / W）；乙酸乙酯∶番茄醬10.1∶1（V / W）；提取時間為372.6 s；微波提取功率為569.5 W；提取率為81.51%。

番茄醬 番茄紅素 微波處理 超聲波處理

番茄紅素是在自然界中發現的最重要的保健和藥用植物色素之一。它是植物在光合作用過程中合成的一類色素，廣泛存在于成熟的番茄、西瓜、粉紅色的葡萄柚、番石榴、木瓜等水果中［1，2］。

番茄紅素的分子結構由11個共軛碳碳雙鍵長鏈組成，所以具有不同的幾何異構體；在自然界中番茄紅素反式異構體占據主導，而順式異構體具有更強的生物活性［3，4］。在體外和體內研究表明，番茄紅素具有降低多種慢性疾病發生的作用，包括某些癌癥、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等［3］。正是由于番茄紅素諸多的保健功能，近年來國內外市場對番茄紅素商業制品的需求也呈顯著上升趨勢，番茄紅素提取工藝也取得了長足的發展。目前，番茄紅素提取主要依賴于利用常規有機溶劑提取番茄紅素和

超臨界流體CO2萃?。⊿CFE）［5，6］。SCFE萃取方法具有一定優勢，但設備和能源消耗非常高。超聲波和微波提取法，可縮短番茄紅素提取時間，提高提取效率［7-13］，并具有設備投入少和能源消耗少等特點［9］。

目前，番茄紅素的提取工藝研究主要以番茄皮為原料。雖然以番茄醬為原料普遍被認為是不經濟的，但以番茄醬為原料的優勢就是可以彌補季節性番茄或番茄皮原料的不足，以實現全年生產。然而，番茄醬含有大量的水和果膠，萃取劑難以滲入內部，從而影響萃取效率。乙醇具有小分子脂溶性的特點性質，易于穿過細胞膜，可代替番茄細胞中的水分，從而降低了番茄醬的水含量，提高番茄紅素的提取效率。

番茄紅素特殊的物理化學特性也是研究番茄紅素提取工藝需要考慮的重要因素。番茄紅素在水中的溶解度有限，選擇適當的溶劑已成為目前研究的重點［14，15］。萃取劑的選擇有兩個重要因素，即提取效率高，不會對人體健康產生危害，產生的廢渣易于處理。但是，大多數萃取效率高的溶劑為石油醚、氯仿等一系列有毒試劑［16］，會帶來食品安全風險。乙酸乙酯是一種無毒的有機溶劑，廣泛應用于食品醫藥等領域，而且里用乙酸乙酯萃取后的廢棄物可以用座肥料。番茄紅素易溶于乙酸乙酯，在乙酸乙酯中非常穩定不易被氧化。有研究顯示用一種極微量的最不穩定的異構化番茄油樹脂13z番茄紅素溶解在乙酸乙酯中放置1周，通過回流技術仍能獲得番茄油樹脂。所以利用乙酸乙酯作為番茄紅素萃取劑不僅避免了食品安全的風險，而且有機會獲得更高的番茄紅素提取效率［17］。

在本研究中通過響應面分析法優化微波處理和超聲處理法提取番茄紅素工藝中，乙醇預處理量、乙酸乙酯與番茄醬物料比、微波和超聲波工作功率和微波和超聲波處理時間等一系列參數的優化，初步確立最佳提取條件，為下一步規?；a奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄醬，購自中基番茄制品有限公司；分析純乙酸乙酯，南京化學試劑有限公司；95%乙醇，無水乙醇、甲苯和甲醇（均為分析純），天津富宇精細化工有限公司；實驗用水均為雙蒸水；蘇丹紅I：純度97. 5%，購自Dr. Ehrenstorfer公司。

NN-5280型微波爐（松下公司），722型分光光度計（上海分析儀器廠），BS2000S型電子天平（德國賽多利斯），JY92-II超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司），101A-2型電熱恒溫干燥箱（上海實驗儀器總廠）。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線制作 精確稱取0.0256 g蘇丹紅I色素（純番茄紅素標準品極不穩定，而蘇丹紅I色素穩定，其乙醇溶液與番茄紅素抽提液的最大吸收波長近似，故用蘇丹紅Ⅰ代替純番茄紅素制作標準曲線）［18］，用少量無水乙醇，定量移入50 mL容量瓶，并用無水乙醇定容至刻度，搖勻。準確吸取上述標準溶液0.126、0.152、0.178、1.104、1.130 mL分別注入一組50 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度搖勻后即相當于0.15、1.10、1.15、2.10、2.15 μg/mL番茄紅素的標準溶液。然后，在番茄紅素抽提液的最大吸收波長下（485 nm），測定其吸光度值，制作標準曲線?；貧w方程如下：y=0.165 1x-0.03 4，R2=0.996 8。

1.2.2 番茄紅素含量的測定 稱取0.1-0.2 g試樣，精確至0.000 2 g，于小燒杯中，用甲醇洗雜，甲苯定容至50 mL，采用分光光度計測定樣品在485 nm處的吸光度，根據標準曲線計算番茄紅素的含量，公式如下：

X=（5×N）/W

其中，X為試樣中番茄紅素的含量（mg/100 g），N：色素提取液中番茄紅素的濃度（mg/L），W：試樣質量（g）。

1.2.3 番茄紅素提取率測定 向一定試樣中加入有機溶劑，提取，過濾，測其體積并精密量取2 mL 至小燒杯中，待溶劑揮干后用甲醇洗雜，并用甲苯定容至50 mL，測其吸光度值，計算提取液中番茄紅素的總量，按公式計算提取率。

提取率（%）=（Mn /M）×100%其中，Mn：提取液中番茄紅素總量（mg），M：原

料中番茄紅素總量（mg），番茄醬中番茄紅素總含量M為每克番茄醬含番茄紅素10.61 mg。

1.2.4 單因素試驗 使用響應面法（RSM）之前進行預試驗，選擇相關變量的酚類抗氧化劑的恢復以及獨立因素的試驗范圍。基于總的番茄紅素含量的平均值，3個層次（上、中、下3個水平），每個設計變量（樣品預處理，微波輔助提取，超聲輔助提取，物料比和超聲輔助提取時間），每個處理重復3次，每個處理番茄醬樣品5 g。

1.2.4.1 樣品的預處理 分別加入無水乙醇：番茄醬（W/V）物料比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和不加無水乙醇6個處理，處理時間為均30 s，處理后樣本4℃存儲。利用料液比1∶1（W/V）乙酸乙酯，功率為620 W微波萃取法萃取處理樣本，萃取時間10 min，0.45 μm微孔真空過濾去除提取物，用722PC分光光度計485 nm下測定濃度。

1.2.4.2 微波提取功率 利用料液比為1∶2（W/V）無水乙醇預處理番茄醬，料液比1∶1（W/V）乙酸乙酯，松下nn-5280微波爐分別在500 W、560 W、620 W、680 W、740 W和800 W 六個不同功率下萃取，萃取時間10 min，0.45 μm微孔真空過濾去除提取物，分光光度計485 nm下測定濃度。

1.2.4.3 微波提取時間 利用料液比為1∶2（W/V）無水乙醇預處理番茄醬，料液比1∶1（W/V）乙酸乙酯，松下NN-5280微波爐620 W分別處理2、4、6、8、10和12 min，0.45 μm微孔真空過濾去除提取物，分光光度計485 nm下測定濃度。

1.2.4.4 超聲波提取功率 利用料液比為1∶2（W/V）無水乙醇預處理番茄醬，料液比1∶1（W/V）番茄醬：乙酸乙酯，jy92-ii超聲波儀分別在100 W、200 W、300 W、400 W和500 W五個不同功率下萃取，萃取時間10 min，0.45 μm微孔真空過濾去除提取物，分光光度計485 nm下測定濃度。

1.2.4.5 溶劑樣品比 利用料液比為1∶2（W/V）無水乙醇預處理番茄醬，番茄醬：乙酸乙酯的料液比分別為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30和1∶40（W/V），jy92-ii超聲波儀300 W萃取，萃取時間10 min，0.45 μm微孔真空過濾去除提取物，分光光度計485 nm下測定濃度。

1.2.4.6 超聲波提取時間 利用料液比為1∶2（W/V）無水乙醇預處理番茄醬，料液比1∶1（W/V）番茄醬∶乙酸乙酯，jy92-ii超聲波儀300 W萃取，萃取時間分別為2 min 、4 min 、6 min、8 min 和10 min，0.45 μm微孔真空過濾去除提取物，分光光度計485 nm下測定濃度。

1.2.4.7 響應面法優化法 響應面法（RSM）分析使用軟件Design- Expert 8.05 利用5水平四因素中心組合設計（CCRD）檢驗分析利用乙醇預處理樣品后，以乙酸乙酯為溶劑，通過微波和超聲波兩種不同方法從番茄醬中提取番茄紅素的優化組合。

2 結果

2.1 單因素試驗

由圖1和圖5所示，無水乙醇和番茄醬料液比由0至5倍（W/V）時，乙酸乙酯和番茄醬料液比由5至40倍（W/V）時，提取效率先極具上升至一定水平時緩慢下降。說明乙醇脫水預處理對于提高番茄紅素萃取效率是非常有效的。無水乙醇∶番茄醬為1∶2比較合適。乙酸乙酯∶番茄醬為1∶10具較好的提取效率。

如圖2和圖4所示，微波功率和超聲功率對番茄醬番茄紅素提取的影響。在微波功率560 W、超聲波功率為400 W提取番茄紅素時效率最高。高功率可能會因溫度過高導致大量番茄紅素的損失。如圖中所示，當處理功率高于這兩個功率時提取效率隨功率的增加而降低。

圖3和圖6給顯示微波法及超聲波法提取時間對提取效率的影響。微波萃取番茄紅素的產量最高值出現在處理時間為6 min左右，提取率為75%，處理時間至8 min時開始急劇下降。超聲提取時間為8 min，提取率為80%。在提取過程中，兩種方法提取效率當達到最高值后，提取率隨著提取時間的增加而降低，提取番茄紅素的效率也會降低。

2.2 響應面法優化分析

根據單因素試驗結果，超聲波和微波兩種不同的提取方法分別利用CCRD的中心組合設計原理，選取提取時間、固液比、乙醇體積分數和提取功率4個因素，分別以X1、X2、X3 和X4表示。每個自變量的低中高水平分別以-2、-1、0、1、2 進行編碼，以番茄紅素為響應值（Y），設計4因素五水平

表如表1。微波輔助提取和超聲波輔助提取番茄紅素CCRD試驗結果（表2）。

圖1 乙醇預處理對提取效率影響

圖2 不同功率微波對提取效率影響

圖3 微波處理時間對提取效率影響

圖4 不同功率超聲波對提取效率影響

圖5 溶劑量對提取效率影響

圖6 超聲波處理時間對提取效率影響

表1 四因素五水平表

30個試驗點分為析因點和零點，試驗號1-24是析因試驗，試驗號25-30是中心試驗。其中析因

點為自變量取值在X1，X2，X3 所構成的三維頂點，零點為區域的中心點，零點試驗重復6次，用以估計試驗誤差。

表2 CCRD設計方案

2.3 超聲波法提取番茄紅素方法優化

根據各因素經回歸擬合后，得番茄紅素含量對選取提取時間、固液比、乙醇體積分數和提取功率的二次多項回歸方程為：

R1=93.87683+0.96604X1+1.79379X2+1.62571X3+ 2.70146X4-1.33781X1X2+0.065562X1X3-1.43869X1X4+ 0.028063X2X3+0.11206X2X4- 0.56531X3X4-2.34851X12-3.21689X22-4.80139X32-3.04001X42

R2=0.9691

模型的可靠性可從方差分析及相關系數來分析。由方差分析（表3）可知，模型在P＜0. 01 時水平顯著，表明試驗設計可靠。相關系數（R2）越接近1，說明模型的預測值與試驗值的相關性越好。本研究的R2=0.9691說明模型能夠較好地描述試驗結果。

從表3可知，一次項中X2、X4；平方項中X2*X2、X4*X4為顯著性影響因素。在各影響因素中，番茄醬與萃取劑乙酸乙酯固液比（X2）和超聲波提取功率（X4）的影響因素最大。在總的作用因素中，1次項和平方項的影響較大，而交互項影響相對較小。X2和X4的變化比另外兩個變量對超聲波萃取法提取效率影響更大。利用超聲波法提取番茄紅素，

提取效率達到最大值后隨提取時間的增加提取效率會逐漸降低如圖7和圖12。根據響應面優化分析結果顯示，超聲波提取番茄紅素最優方法為萃取時間490 s，固液比1∶10.1，番茄醬與乙醇固液比1∶2.05和超聲波功率405 W。參照這個條件進行試驗，提取效率達94.32%，與利用公式計算所得預測結果94.42%相近，得出相應的曲面圖見圖7-12。

表3 超聲波提取法回歸系數取值及分布結果

圖7 提取功率與乙醇預處理用量對番茄紅素提取效率影響曲面圖

圖8 提取功率與乙酸乙酯萃取量對番茄紅素提取效率影響曲面圖

2.4 微波法提取番茄紅素方法優化

根據各因素經回歸擬合后，得各變量的二次多項回歸方程為：

Y（%）=81.37367+0.42683X1+0.38517X2+ 0.62183X3+0.36800X4-0.20525X1X2-0.059250X1X3-0.080750X1X4-0.2 3587X2X3+0.21487X2X4-0.44338X3X4-0.9727X12-0.85908X22-0.97158X32-1.78258X42

R2=0.9215

公式中相關系數（R2）值為0.9215說明預測

值與實驗值的相關性較好，模型能夠很好地描述實驗結果。一次項中X1、X3和X4；平方項中X1*X1、X3*X3和X4*X4為顯著性影響因素。在各影響因素中，番茄醬與乙醇固液比（X2），萃取時間（X3）和提取功率（X4）的影響因素最大。在各個作用因素中，1次項和平方項的影響較大，而交互項影響相對較小（表4）。利用微波提取法X2、X3和X4對提取效率影響較大。

圖9 提取時間與乙醇預處理體積對番茄紅素提取效率影響曲面圖

圖10 乙酸乙酯用量與乙醇預處理體積對番茄紅素提取效率影響曲面圖

圖11 提取功率與提取時間對番茄紅素提取效率影響曲面圖

圖12 乙酸乙酯用量與提取時間對番茄紅素提取效率影響曲面圖

根據響應面優化分析結果顯示微波提取番茄紅素最優方法為萃取時間372.6 s，固液比1∶10.1，番茄醬與乙醇固液比1∶2.11和微波功率569.5 W。參照這個條件與利用公式（2）計算所得預測結果81.51，得出相應的曲面圖見圖13-18。

3 討論

目前，國內外利用超聲波和微波處理提取番茄紅素的方法進行了大量研究。但是，番茄紅素的提取方法多以番茄皮和新鮮番茄為原料，單獨分析以乙醇預處理、乙酸乙酯萃取、超聲波或微波法等因素做單一分析。結合這幾種方法對其工藝的研究相對較少。本研究利用響應面分析法綜合分析優化乙醇原料進行脫水預處理、以乙酸乙酯使用量、聲波或微波法的處理功率及時間等因素，建立一套高效的從番茄醬中提取番茄紅素工藝。

根據單因素試驗結果顯示：乙醇、乙酸乙酯、微波提取功率、超聲波提取功率、微波提取時間和超聲波提取時間的變化趨勢相似，提取效率先升高然后下降。乙醇的加入使番茄醬中的細胞脫水，有利于進一步有機溶劑萃取番茄紅素。由于在增加提取過程中乙醇的加入量增加過導致番茄紅素的損失也隨之增大，當損失率超過提取率時，提取效率開

始下降［19］。番茄醬：乙酸乙酯固液比為1∶10后提取效率基本達到平衡，1∶10說明這個比例為最優比例。微波和超聲波處理在一定范圍內能有效提高提取效率，微波提取功率和超聲波提取功率的功率增加時會產生相應的熱量，功率越大熱量產生的越多，番茄紅素在加熱過程中分解量會增加，當提取量少于分解量時提取效率開始降低。微波提取法會加速目標化合物從基質的吸附和解吸的提取過程，但其缺點是加熱不均勻［11］。番茄紅素在長時間超聲波作用下可能發生分解變性［20］。但在相同時間內，超聲波提取法提取效率遠高于微波提取法，可能超聲破碎細胞效率比微波更徹底。

表4 微波提取法回歸系數取值及分布結果

圖13 提取功率與乙酸乙酯用量對番茄紅素提取效率影響曲面圖

圖14 乙醇預處理體積與乙酸乙酯用量對番茄紅素提取效率影響曲面圖

圖15 提取功率與提取時間對番茄紅素提取效率影響曲面圖

圖16 乙醇預處理體積與提取時間對番茄紅素提取效率影響曲面圖

圖17 乙酸乙酯用量與提取時間對番茄紅素提取效率影響曲面圖

4 結論

圖18 提取功率與乙醇預處理體積對番茄紅素提取效率影響曲面圖

超聲波法提取效率明顯高于微波提取法。利用乙醇脫水的番茄醬，在相同條件下微波提取法和超聲波提取法均比張連富［21］試驗方法提取效率高5%。

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（責任編輯 李楠）

Research on the Method of Extraction of Lycopeneprepared by Optimizated Ethanol Using Response Surface Analysis

Shen Haitao Wang Aiying Zhu Jianbo
（College of Life Sciences of Shihezi University；Key Agriculture Biotechnology of Shihezi University，Shihezi 832003）

To research the methond of extraction of lycopene repared by optimizated ethanol using response analysis. The effects of ethanol pretreatment, extracting solvent, microwave assisted extraction and ultrasonic assisted extraction, were evaluated by using a central composite rotatable design. Using the dehydration processing tomato sauce can obviously improve the extraction efficiency of Lycopene. Then, the central composite design and response surface analysis were used to determine the optimal levels of the main factors. The optimal extracting conditions and lycopene yields of ultrasound assisted extraction technology were described as follows：the extraction time, 490 s；the ratio of solvent to tomato sauce, 10.1：1（V/W）；the ratio of anhydrous ethanol to tomato sauce, 2.05：1（V/W）；extraction power, 405 W；lycopene yields, 94.42%. The optimal extracting conditions and lycopene yields of microwave assisted extraction technology were described as follows：the extraction time, 372.6 s；the ratio of solvent to tomato sauce, 10.1：1（V/W）；the ratio of ethanol to tomato sauce, 2.11：1（V/W）；extraction power, 569.5 W；lycopene yields, 81.51%. Results showed that pretreated by ethanol, power, extracting time and extracting solvent were the main affecting factors.

Tomato sauce Lycopene Microwave treatment Ultrasonic treatment

2013-09-06

轉基因動植物新品種國家重大專項（2011zx08011-002），石河子大學科學技術研究發展計劃（2012ZRKXYQ-YD15）

沈海濤，男，碩士，助理研究員，研究方向：植物基因工程；E-mail：ghost521@126.com

祝建波，研究員，研究方向：植物基因工程；E-mail：274831213@qq.com