大豆轉錄因子GmERF5啟動子的克隆及活性分析

大豆轉錄因子GmERF5啟動子的克隆及活性分析

翟瑩1張軍2趙艷1孫天國1姚雅男3楊曉杰1
（1.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院 遺傳重點實驗室，齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省獸醫科學研究所，齊齊哈爾 161006；3.長春農業博覽園，長春 130117）

乙烯響應因子（Ethylene-responsive factors，ERFs）廣泛參與植物對生物和非生物脅迫的應答。從大豆吉林32的基因組DNA中分離到GmERF5的啟動子片段，全長1 924 bp。該區段含有9種與逆境相關的順式作用元件，即G-box、GT-1、LTRE-1、W-box、TL1、DPBF、MYB、MYC和BIHD10S。將該啟動子構建到植物表達載體pCAMBIA1301上與葡萄糖苷酸酶（GUS）基因融合，注射法轉化煙草葉片，并進行干旱、高鹽和低溫處理，通過GUS組織化學染色和GUS熒光值的測定分析啟動子的啟動活性。結果表明，在未處理條件下，該啟動子能驅動下游GUS基因的表達。干旱和低溫處理10 h能明顯增強GmERF5P的啟動活性。

大豆 GmERF5 GUS活性 啟動子 逆境誘導

當植物處于不利的環境中時會迅速激活相關的信號轉導途徑［1］，合成大量逆境相關的基因產物，包括酶、分子伴侶、離子通道蛋白和轉運體等［2］，使植物更好的適應各種生物和非生物脅迫。其中，逆境相關轉錄因子由于可以和啟動子中特定的元件結合，通過調節自身的改變從而調控下游多個目的基因的表達而在植物適應不利環境條件方面發揮重要作用［3］。乙烯響應因子（Ethylene-responsive factors，ERFs）是植物中特有的一類轉錄因子，廣泛參與植物對生物和非生物脅迫的應答。自Ohme-Takagi和Shinshi［4］首次從煙草中分離出4個ERF基因以來，已從擬南芥、番茄、水稻、小麥、玉米等不同植物中相繼獲得大量ERF基因。近年來，將擬南芥中的ERF轉錄因子HARDY在三葉草中異位表達，降低了轉基因植物的蒸騰作用和對鈉離子的攝入量，從而提高了轉基因三葉草的抗旱性和抗鹽性［5］。超表達SlERF1的轉基因番茄與野生型相比含有更高的相對含水量、脯氨酸含量和可溶性糖含量，提高了轉基因番茄的抗鹽性［6］。另外，將番茄中的另一個ERF轉錄因子TSRF1在煙草和番茄中過表達，通過GCC-box激活抗病基因的表達可提高轉基因植物的抗病性，而將其在水稻中過表達則可以通過調控脅迫響應基因的表達來提高轉基因水稻的抗旱性［7］。從擬南芥中分離出一個受低氧、高鹽、ABA和紫外

輻射誘導的AtERF71/HRE2，將其在擬南芥中超表達提高了轉基因擬南芥對高鹽、水淹和紫外輻射的抗性［8］。由此可見，ERF轉錄因子的應用是提高農作物綜合抗逆能力的有效策略。

植物基因的啟動子位于基因5'端上游區域，調控基因的轉錄起始和頻率，使基因在不同的組織器官、不同的發育時期以及不同環境條件下表達［9］。啟動子序列除含有基本元件TATA-box和CAAT-box外，還存在一些特異性的順式作用元件，它們可以與轉錄因子蛋白等調節蛋白質協同作用［10］。研究轉錄因子基因的啟動子有助于理解該基因的逆境脅迫調控機制及信號調控網絡。然而，到目前為止關于ERF基因啟動子及其表達調控的研究報道并不多。

本研究前期從大豆品種吉林32中分離出一個可以被逆境脅迫所調控的ERF轉錄因子GmERF5（GenBank登錄號為JN416600）［11］。為研究GmERF5的表達調控模式及其在大豆脅迫響應中的調控功能，本研究分離出GmERF5的啟動子片段，進行生物信息學分析，并構建植物表達載體轉化煙草葉片，分析該啟動子對干旱、高鹽和低溫的應答反應。

1 材料與方法

1.1 材料

供試大豆（Glycine maxL.）吉林32由吉林大學植物種質資源與利用研究室提供；煙草（Nicotiana tabacumL.）NC89由本實驗室保存；載體pCAMBIA-1301、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α及根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1GmERF5基因啟動子的克隆和序列分析 利用已克隆到的大豆GmERF5轉錄因子cDNA序列搜索大豆基因組數據庫GmGDB（http：//www.plantgdb. org/GmGDB/），獲得其上游大概2 000 bp的啟動子序列。利用引物設計軟件Primer5設計引物，在其兩邊，引物序列如下（下劃線部分為EcoRI 和NcoI酶切位點）F：5'-GGGAATTCGCTATTCCCCTAAACTTTG-3'；R：5'-GGCCATGGGTTTCTTCTTCAGAACTTGAG-3'。以大豆吉林32葉片DNA為模板，進行PCR擴增。PCR程序為94℃ 8 min；94℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 1 min，進行30個循環；72℃延伸8 min。PCR產物經切膠回收后連接至pMD18-T載體，將篩選獲得陽性質粒命名為pMD18-T-GmERF5P，并送華大基因進行測序。測序結果利用DNAMAN軟件進行序列比對，PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）數據庫用于啟動子順式作用元件的預測分析。

1.2.2 表達載體的構建 將測序正確的pMD18-TGmERF5P質粒和pCAMBIA1301質粒分別用EcoR I 和NcoI 雙酶切后經T4連接酶過夜連接，以菌液PCR和雙酶切鑒定陽性克隆。利用凍融法將表達載體pCAMBIA1301-GmERF5P和pCAMBIA1301分別轉化農桿菌EHA105。

1.2.3 煙草葉片的轉化及脅迫處理 農桿菌介導的煙草葉片的轉化參照Yang等［12］的方法并加以改進。煙草苗采用盆栽，于溫室中培養6周后開始進行處理。將分別含有pCAMBIA1301-GmERF5P載體和pCAMBIA1301空載體的農桿菌菌液于YEP培養基中，28℃，120 r/min（搖床），振蕩培養至OD600大約為0.6時，2 000×g離心15 min收集菌體，用MS液體培養基（附加10 mmol/L MES和100 μmol/L AS）重懸菌體至OD600大約為0.8。用1 mL注射器，分別抽取1 mL重懸后的菌體和對照MS重懸液注入到煙草植株幼嫩葉片的葉脈間，做好標記，覆膜保濕培養40 h后對煙草整株進行各種脅迫處理。將注射后的煙草苗分別置于含10 % PEG8000和200 mmol/L NaCl的水溶液中進行干旱和高鹽處理；于4℃培養箱進行低溫處理。處理后10 h取樣進行GUS基因表達的檢測。

1.2.4GUS基因表達的檢測 參照Jefferson［13］的方法對GUS報告基因的表達進行檢測。將處理后的煙草葉片剪下進行GUS組織化學染色：加入GUS染色液［14］，于37℃溫育過夜，用75 %的乙醇脫色至底色完全消失。另將0.1 g處理后的煙草葉片在液氮中研磨成粉末，加入600 μL酶提取緩沖液，4℃離心，用Bradford法［15］測定上清液中的蛋白濃度。取出部分上清液加GUS反應底物4-MUG，于37℃反應10 min，在熒光分光光度計上進行GUS熒光值的測定。試驗設置3次生物重復，用獲得的熒光值除以蛋白濃度和時間得到GUS相對活性。

2 結果

2.1GmERF5啟動子的擴增

將已獲得的逆境誘導相關轉錄因子GmERF5的cDNA序列輸入大豆基因組數據庫進行搜索，獲得該序列上游大概2 000 bp的DNA序列。進一步設計引物，通過PCR從大豆吉林32的葉片DNA中擴增得到1 924 bp的GmERF5啟動子序列，命名為Gm-ERF5P。經分析該序列富含A/T（含量達73.1 %），這是植物啟動子序列的主要特征之一。

2.2GmERF5P的序列分析

利用數據庫PLACE對獲得的啟動子序列進行分析，結果（圖1）表明，GmERF5P除含有基本啟動子特征元件TATA-box和CAAT-box外，還含有與逆境相關的9種順式作用元件，即：3個與脫水響應相關的G-box元件、11個病原體和鹽誘導響應相關的GT-1元件、1個低溫響應相關的LTRE-1原件、1個傷害響應相關的W-box元件、1個抗病相關的TL1元件、1個ABA誘導轉錄因子DPBF的結合位點、4個脫水響應相關的MYB轉錄因子識別位點、5個脫水和冷誘導相關的MYC轉錄因子識別位點和2個抗病相關的OsBIHD1轉錄因子結合位點BIHD10S。

圖1 GmERF5P DNA序列的生物信息學分析

2.3GmERF5P的逆境誘導瞬時表達

煙草葉片的GUS染色結果（圖2）表明，僅注射對照重懸液的煙草葉片都沒有被X-Gluc溶液染成藍色，而轉化pCAMBIA1301空載體的煙草葉片在未處理和3種逆境處理條件下都可以被X-Gluc溶液染成較一致的深藍色，說明GUS報告基因在煙草葉片中能夠被pCAMBIA1301載體上的煙草花葉病毒

35S（CaMV35S）組成型啟動子啟動，且基本不受以上3種逆境處理的調節。在未處理條件下，轉化pCAMBIA1301-GmERF5P的煙草葉片被X-Gluc溶液染成淺藍色，表明在正常條件下GmERF5P本身具有啟動活性，但與CaMV35S相比，其啟動活性較弱。經過干旱和低溫處理后，煙草葉片呈現出的藍色比未處理時的藍色深，表明GmERF5P的啟動活性在處理10 h時能被干旱和低溫所誘導，使下游目的基因的表達量增高。但高鹽處理10 h對GmERF5P的啟動活性影響不大。

圖2 逆境誘導后煙草葉片GUS組織化學染色

煙草葉片的GUS熒光值檢測結果與GUS染色結果相符合。如圖3所示，干旱和低溫處理10 h均能使GmERF5P的啟動活性有不同程度的增強，而高鹽處理則沒有提高GmERF5P的啟動活性。

圖3 逆境誘導后煙草葉片GUS活性分析

3 討論

影響外源基因在轉基因植物中表達的因素有很多，其中以啟動子的調控最為關鍵。逆境誘導啟動子僅在植物遭受逆境脅迫時才大量啟動下游抗逆基因的表達，可以避免外源基因在轉基因植物中持續表達所造成諸多負面影響［16，17］。因此，逆境誘導啟動子的使用對植物應對逆境環境具有重要的意義。

GmERF5是從大豆吉林32中分離到的一個編碼ERF轉錄因子基因，能夠被多種生物及非生物脅迫所誘導［11］。長度為1 924 bp的GmERF5基因啟動子片段能夠在干旱和低溫處理10 h后明顯提高下游報告基因的表達量，具有一定的逆境誘導活性。此結果與前期研究結果相符，實時熒光定量PCR結果表明大豆中GmERF5基因在干旱和低溫處理10 h后表達量上升明顯，而高鹽處理10 h后基因表達量變化不大［11］。利用生物信息學方法對GmERF5P上的順式作用原件進行預測，發現其含有多個與脫水、高鹽、低溫、病原物和傷害等逆境相關的順式作用元件，由此推測各種逆境環境可能就是通過這些順式作用元件來調節GmERF5基因的表達，進而再通過GmERF5所介導的信號路徑調控大豆對生物及非生物脅迫的響應，從而表現出復雜的調控方式。逆境處理10 h，GmERF5P對干旱處理的響應最為明顯，序列分析結果表明GmERF5P上存在3個脫水響應元件G-box；其次是對低溫的響應，GmERF5P序列僅存在1個低溫響應元件LTRE-1；盡管GmERF5P序列上存在11個鹽誘導響應元件GT-1，但其對高鹽處理的響應不明顯。由此表明啟動子的逆境誘導活性不僅只取決于逆境誘導元件的個數，還應該由元件的種類及相對位置等共同決定［18］。另外GmERF5基因的表達還可能受到MYB轉錄因子、MYC轉錄因子等逆境相關轉錄因子的調控［19］。但是，具體是哪些元件在GmERF5P中發揮關鍵作用，尚需要進一步的研究。

啟動子序列中的A/T含量與啟動子的啟動活性呈正相關，這些序列的功能很可能是與植物細胞核內的A/T豐富序列結合蛋白相作用，從而對基因的表達起調控作用［20，21］。GmERF5P序列中含有大量A/T序列，推測其可能具有較高的啟動效率。通過

GUS組織化學染色和GUS熒光值的測定，證明了GmERF5P即使在未誘導條件下也能有效地啟動下游GUS報告基因的表達。但GmERF5P啟動子無論在未處理還是在逆境處理10 h后其啟動強度都明顯低于CaMV35S啟動子，這可能是由于GmERF5P序列相對較長，遠端可能存在負調控元件，也可能與逆境處理時間有關，這方面仍需做啟動子缺失和逆境誘導時間相關試驗來進一步驗證［19］。

4 結論

本研究首次克隆了大豆轉錄因子GmERF5基因的啟動子序列，該區段含有9種與逆境相關的順式作用元件。將該啟動子構建植物表達載體并轉化煙草葉片。在未處理條件下，該啟動子能驅動下游GUS基因的表達，干旱和低溫處理10 h能明顯增強Gm-ERF5P的啟動活性。

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（責任編輯 狄艷紅）

Cloning and Activity Analysis of Soybean GmERF5Promoter

Zhai Ying1Zhang Jun2Zhao Yan1Sun Tianguo1Yao Yanan3Yang Xiaojie1
（1. College of Life Science and Agro-forestry，Qiqihaer Univesity，Key Laboratory of Genetics，Qiqihaer 161006；2. Heilongjiang Institute of Veterinary Science，Qiqihaer 161006；3. Changchun Agriculture Expo Garden，Changchun 130117）

ERF transcription factor family is extensively involved in the biotic and abiotic responses. The GmERF5 promoter（1 924 bp）was isolated from soybean genome using PCR. Sequence analysis indicated that GmERF5P contains several stress-induced elements：G-box, GT-1, LTRE-1, W-box, TL1, DPBF, MYB, MYC and BIHD10S. GmERF5P was subcloned into pCAMBIA1301 vector to drive the GUS gene to express in tobacco leaves by Agrobacterium-mediated injection transformation. The activity of GmERF5P was analyzed using histochemistry staining and GUS fluorescence intensity analysis. The results indicated that GmERF5P activated expression of GUS report gene under normal growing conditions. The activity of GmERF5P was up-regulated after the treatments of drought and low temperature for 10 h.

Soybean GmERF5P GUS activity Promoter Stress-induced

2013-09-06

齊齊哈爾大學青年教師科研啟動支持計劃項目（2012k-M20）

翟瑩，女，博士，講師，研究方向：大豆分子育種；E-mail：fairy39809079@126.com