香蕉ASR的特征和采后表達分析

香蕉ASR的特征和采后表達分析

賈彩紅1徐碧玉1劉菊華1張建斌1馮仁軍1金志強2
（1.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所 農業部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海口 570101；2.中國熱帶農業科學院海口試驗站 海南省香蕉遺傳改良重點實驗室，海口 570101）

從香蕉cDNA文庫中獲得香蕉ASR全長cDNA序列，命名為MaASR。構建遺傳進化樹發現MaASR與單子葉植物中的芭蕉科植物的親緣關系較近。對正常成熟和乙烯處理的香蕉果實各時期內源ABA的含量進行測定，結果表明，在正常成熟的香蕉果實中，成熟早期（0-2 d），內源ABA含量相對較低，第8天ABA含量達到最大，隨后迅速下降。在乙烯處理的香蕉果實中，ABA含量急劇上升，第3天ABA含量達到高峰，隨后逐漸下降。利用熒光定量RT-PCR對MaASR在正常成熟和乙烯處理后的果實中的表達情況進行分析，在自然成熟的果實中，MaASR在采后2 d達到高峰，而后迅速下降，在6-16 d時一直保持較低水平。在經外源乙烯誘導的果實中，MaASR表達水平沒有表現出劇烈變化的趨勢，整體表達量較低。表明MaASR對乙烯信號有應答，但應答強度較低，其表達趨勢與ABA的含量或者信號強度呈負相關。

香蕉 ASR 特征 表達分析

ASR編碼的蛋白是一類分子量小，親水性強，具有較高熱穩定性的蛋白。所有植物中的ASR都具有兩個高度保守的結構域：一是位于N端的含有大量組氨酸的依賴于Zn2+的DNA結合序列，二是位于C端的一個核定位信號［1］。對最早克隆到的番茄中的Asr1進行研究發現，Asr1蛋白定位于番茄細胞的細胞核中，說明ASR多數是定位在細胞核中［1，2］。

近年來，從馬鈴薯（Solanum tubersum）［3］，玉米（Zea mays）［4］，松樹（Pinus taeda）［5］，水稻（Oryza sativa）［6］，百合（Lilum longifera）［7］和葡萄（Vitis vinifera）［8］等植物中都克隆到了該基因。但是，不同物種中的ASR的表達方式不盡相同。例如，ASR在番茄［9］、甜瓜［10］和葡萄［8］的果實中表達，也在馬鈴薯的塊莖［3］、松樹的根部［11］、水稻［6］和玉米［4］

的葉片和莖，以及百合的花粉［12］中表達，這說明ASR可能參與了植物發育的各個過程。由于材料的可操作性限制，雖然在番茄［9］，甜瓜［10］和草莓［13］等植物中等發現了ASR的表達，但其在果實成熟方面的功能研究進展要緩慢得多。

香蕉是生長于熱帶和亞熱帶地區的一種重要的經濟作物，對其果實的后熟機制研究有著重大的實際意義。前期我們從香蕉果實成熟早期差異表達cDNA microarray中篩選到上調表達的ASR，并發現在果實呼吸躍變前的芯片數據中，該基因的表達水平較低，說明該基因可能在果實成熟早期發揮作用。因此研究該基因在香蕉果實成熟過程中的作用，可以為研究該基因在果實成熟發育中的作用奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉（Musa acuminateL. AAA group cv. Brazilian）果實（開花后100-120 d）從中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所澄邁香蕉種植園獲得。

1.2 方法

1.2.1MaASR基因的獲得 根據蘇偉［14］的SSH試驗結果中的CX-BF81（61）片段（該片段與ABA成熟與脅迫誘導蛋白基因同源）來設計序列特異性引物，利用本實驗保存的香蕉果實cDNA文庫擴增基因。所用BR61 5'端引物：5'-caagcatcccacactcaatac-3'，BR61 3'端引物：5'-cacaagcacaagatcgagg-3'。所用接頭引物pTr5'：5'-ctccgagatctggacga-gc-3'；pTr3'，5'-taatacgactcactcactataggg-3'。

1.2.2MaASR基因的生物信息和系統發生分析 利用ORF（Open reading frame）Finder軟件對MaASR基因cDNA序列的開放閱讀框和編碼的氨基酸序列進行分析。并通過Conserve Domain Research軟件分析MaASR推導氨基酸序列的保守結構域。在NCBI中利用blastx進行序列的同源性分析，并從中選取相似性較高的9個同源序列用Vector NTI軟件進行氨基酸序列的多重比對。另外，為了確定MaASR與其他物種中同源基因的親緣關系，選擇了ASR基因家族中已發表的23個同源序列，用NJ法構建系統發生樹。

1.2.3 果實采后的處理方法 將采收的開花后100-120 d的香蕉果實切割成單蕉指，用0.1%次氯酸鈉表面消毒10 min，抹掉果實頂部的干花。晾干后，隨機選取果實分為兩組。第1組：正常成熟的果實；第2組：外源乙烯誘導成熟的果實；每組30個果實。每一取材時期每組中取3個果實。第一組果實置于22℃恒溫條件下自然成熟；第二組果實置于充有100 μL/L乙烯的密閉保鮮盒中，22℃放置18 h后開蓋，在22℃恒溫條件下成熟［15］。

1.2.4 香蕉果實采后乙烯釋放量的測定 對處理的香蕉果實在正常成熟的采后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 d，外源乙烯誘導后0、1、2、3、4、5、6、7 d時分別取樣，測定乙烯的釋放速率。

果實乙烯釋放速率測定的方法如下：將3個果指放入體積為0.5 L的密封罐中，封罐3 h。用1 mL注射器抽出氣體，用日本島津GC2010型氣相色譜儀測定果實乙烯釋放速率，每個樣品測定3次。氣相色譜的工作條件為：火焰離子化檢測器（FID），載體為60-80目AI2O2，柱溫90℃，進樣氣溫度100℃，載氣為N2，流速為25 mL/min［16］。測定完成后，量取果實的體積和質量，計算香蕉果實單位體積質量下的乙烯的釋放速率。

1.2.5 香蕉果實采后內源ABA的測定 取采后0、2、6、10、12、14、16 d自然成熟和乙烯處理的0、1、2、3、4、5、6 d的果實0.5 g，加入2 mL預冷的80%甲醇溶液，在冰浴下研磨成勻漿。將勻漿液轉入10 mL試管，再用2 mL提取液分次將研缽沖洗干凈，一并轉入試管中。搖勻后，將試管放置在冰箱中4℃下提取4 h，1 000 g離心15 min，取上清液。然后，再在沉淀中加入1 mL提取液，重復提取 1 h，合并上清液并記錄體積，棄去殘渣。吸取上清液過C18植物色素固相吸附柱除去葉綠素，轉入5 mL塑料管中，真空抽干。采用ELISA法測定激素含量，試劑盒購自中國農業大學。所有指標的測定都重復3次，取其平均值。

1.2.6 果實采后不同階段總RNA提取和cDNA第一鏈的合成 分別在香蕉果實正常成熟的采后0、2、6、10、12、14、16 d，外源乙烯誘導后的0、1、2、3、4、5、6 d取材，將材料切成小塊，迅速置于液氮中冷凍，于-70℃冰箱中貯存，用于總RNA提取。RNA提取參照改良的CTAB方法［17］。取4 μg總RNA，

用Invitrogen的SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase合成cDNA第一鏈，具體操作參照Invitrogen的SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase Kit說明書。

1.2.7 熒光定量PCR分析香蕉果實在不同處理下MaASR在mRNA水平上的表達 利用熒光定量PCR對MaASR在香蕉不同處理下的表達進行分析。反應體系為：12.5 μL的2XSYBR Green PCR Master Mix，0.5 μL的ROX，100 ng的反轉錄RNA。MaASR引物為：5'端引物：5'-AGAAGCATCACCACCATCTC-3'（10 pmol），3'端引物：5'-CAAGCATCCCACACTCAACAC -3'（10 pmol）。Actin引物為：5'端引物：5'-CGAGGCTCAATCAAAGA-3'（10 pmol），3'端引物：5'-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3'（10 pmol）。反應程序為：94℃預變性 3 min，94℃變性7 s，55℃ 退火15 s，72℃ 延伸20 s，40個循環。Actin作為內對照，每個反應重復3次。

2 結果

2.1 MaASR的獲得

MaASRcDNA擴增結果如圖1所示。對所獲得的基因片段送上海生物工程有限公司測序，測序結果用BLASTx比對發現該基因與水稻、甘蔗和百合的Asr1的同源性分別為86%、84%和86%，因此將其命名為MaASR。

圖1 PCR擴增

2.2 MaASR推導氨基酸序列與其他物種中ASR序

列的比對

本研究從香蕉cDNA文庫中獲得MaASR全長cDNA序列，該基因在香蕉成熟早期上調表達。ASR基因是特異存在于高等植物中的一類調控基因，用Vector NTI軟件對從8種植物中獲得11個ASR家族成員進行多序列比對分析，結果（圖2）顯示，MaASR推導的氨基酸序列與番茄（LeAsr1、LeAsr2、LeAsr3，登錄號分別為AAA34137、CAA52873和CAA52874）、葡萄（VvMSA，登錄號AAK69513）、松樹（LP3，AAB07493）、水稻（OsASR1，AAB96681）和玉米（ZmASR1，CAA72998）等植物中的ASR氨基酸序列相比，在N端和C端各有一個較為保守的區域。圖2中位于N端的A區域編碼該家族成員所特有的依賴于Zn2+的DNA結合位點，而位于C端的B區域則代表一個核定位信號。

2.3 MaASR推導的氨基酸序列的系統發生分析

根據ASR家族中已發表的序列，用NJ法構建系統發生樹，結果如圖3，MaASR推導的氨基酸序列與單子葉植物中芭蕉科植物中的親緣關系較較近，與雙子葉植物中的親緣關系較遠，與單子葉植物中的禾本科植物親緣關系最遠。

2.4 香蕉果實采后成熟過程中內源乙烯釋放速率

測定

圖4中的結果顯示，正常成熟條件下，香蕉果實采后成熟前期（0-8 d）乙烯的釋放速率很低，僅不到0.2 ng/ （g·h）。并且在采后8 d內，其變化非常緩慢。10 d時，乙烯釋放速率開始升高。隨著成熟時間的推移，上升幅度逐漸增大，在采后14 d達到峰值，此時的釋放速率約是第8 d的20倍，達到26.212 ng/（g·h）。14 d后，乙烯的釋放速率開始降低，在采后18 d下降到最低值。用外源乙烯處理香蕉誘導成熟時，內源乙烯的釋放不經過采后成熟前期長達8 d的低水平階段，而是在采后第1天就開始增加，達到2.358 ng/（g·h），并在第3天達到最大值29.052 ng/（g·h），比正常成熟的乙烯高峰提前了11 d。

2.5 香蕉果實采后成熟各時期的內源ABA含量測定

對香蕉果實采后自然成熟各時期內源ABA的含量進行測定，結果（圖5）表明，在正常成熟的香蕉果實中，成熟早期（0-2 d），內源ABA含量相對較低。2 d后，ABA的水平逐漸升高。在采后10 d時達到最高峰，含量為725.77 ng/g FW。10-12 d間，果實中內源ABA的積累迅速減少，到12 d時含量僅為101.6534 ng/g FW。在乙烯處理的香蕉果實中，ABA含量在貯藏過程中急劇上升，第3天ABA含量

已到達高峰，含量為1345.64 ng/g FW。

圖2 MaASR推導的氨基酸序列的多序列比對

2.6 MaASR在香蕉果實不同處理下的表達分析

利用qRT-PCR對MaASR在正常成熟和乙烯處理后的果實中的表達情況進行分析，結果（圖6）顯示在自然成熟的果實中，MaASR在采后2 d達到表達高峰（表達量為5.38），而后迅速下降，在10-16 d時一直保持較低水平。在經外源乙烯誘導的果實中，MaASR表達水平沒有表現出劇烈變化的趨勢，整體表達量較低。其中，在乙烯誘導后3 d時表達量小幅度上升，且該表達水平一直保持到第6天完成整個成熟過程。

3 討論

本研究從香蕉cDNA文庫中獲得MaASR全長cDNA序列，命名為MaASR。多序列比對發現該基因在N端和C端各有一個較為保守的區域。進化樹分析表明，MaASR與與單子葉植物中芭蕉科植物中的親緣關系較較近，與雙子葉植物中的親緣關系較遠，與單子葉植物中的禾本科植物親緣關系最遠。這表明香蕉雖然屬于單子葉植物中的芭蕉科，但香蕉中的該類基因在聚類分析上并不能代表香蕉屬于單子葉植物中的特性，這種關系還需要進一步的研究證明。

MaASR的表達并沒有受到外源乙烯地大量誘導，只是在采后第3天時表達水平稍有升高，為0 d時的2倍。而內源乙烯的生物合成在3 d時也達到高峰。這說明外源乙烯誘導內源乙烯的生物合成提前達到最大峰值時，也對MaASR的表達有促進作用。這說明MaASR對乙烯信號有應答，但應答強度較低。

而且，MaASR對乙烯的應答是通過直接作用還是通過間接途徑來相互影響還不能確定。Hong等［19］分離香瓜中的Asr1的啟動子區，發現在ABRE上游不遠處存在乙烯應答元件（Ethylene responsive element，ERE），說明ASR家族一些基因可能對乙烯有直接應答。但是陳尚武等［20］認為ABA生物合成抑制劑Fluridone可以通過抑制果實組織ABA的合成、降低果實內源ABA的濃度，干預ABA對乙烯合成過程和細胞壁軟化過程的關鍵酶活性調控作用，而實現影響果實成熟，說明ABA可能是果實成熟過程中位于乙烯上游的內源調控因子。所以，MaASR對乙

烯的應答也可能是通過參與ABA途徑來間接實現的。MaASR基因對乙烯的應答機制還有待于進一步地研究。

圖3 MaASR推導氨基酸序列與其它植物ASR氨基酸序列的系統發生分析

圖4 香蕉果實正常成熟和外源乙烯處理處理下內源乙烯的釋放速率

圖5 果實采后自然成熟和乙烯處理內源ABA含量變化曲線

圖6 MaASR在果實正常成熟和乙烯處理下的表達

由于MaASR在香蕉成熟早期顯著上調，為了探索MaASR與香蕉果實成熟的關系，檢測了MaASR與香蕉果實成熟過程最重要的兩大激素——ABA和乙烯之間的關系。在正常成熟的果實中，MaASR在采后成熟早期（采后2 d）的上調表達較為明顯，這與草莓中的研究結果相似［13］，但是在2 d后迅速下降，直到完成整個成熟過程，而在乙烯處理的香蕉果實中的表達變化不明顯，一直處于較低的水平。對果實自然成熟過程和乙烯處理的不同時期的內源ABA含量進行測定，發現在自然成熟的香蕉果實中，早期（0-2 d）內源ABA含量相對較低，2 d后ABA的水平逐漸升高，在采后8 d時達到最高峰，8-10 d間，果實中內源ABA的積累迅速減少；在乙烯處理的香蕉果實中，ABA的含量逐漸升高，到第3天時含量達到最大，隨后逐漸降低，但乙烯處理的催熟果實的ABA含量峰值高于正常成熟果實的，且高峰出現的比正常成熟的早，本研究結果與蔣躍明等［21］的研究結果一致。根據內源ABA含量變化與MaASR的表達變化趨勢，我們推測MaASR在果實成熟早期可能誘導ABA的的生物合成，但在內源ABA含量達到高峰后，又反饋抑制了MaASR的表達。以上結果表明，MaASR可能是通過參與香蕉果實采后早期的ABA途徑來影響果實的成熟過程。

通過對MaASR的研究發現該基因與ABA之間的關系非常密切，由于ABA參與調控植物生長發育的各個層面，尤其是逆境脅迫，種子萌發和果實成熟等方面，所以認為MaASR可能是通過參與到ABA的信號或合成過程來在不同的器官中發揮調節作用，這一推測還需要進一步的證據來驗證。

4 結論

MaASR基因與單子葉植物中芭蕉科植物的親緣關系較近，與雙子葉植物的親緣關系較遠，與單子葉植物中的禾本科植物關系最遠。

MaASR對乙烯信號有應答，但應答強度較低，其表達趨勢與ABA的含量或者信號強度呈負相關。

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（責任編輯 李楠）

Characteristic and Expression Analysis of ASR Gene from Banana

Jia Caihong1Xu Biyu1Liu Juhua1Zhang Jianbin1Feng Renjun1Jin Zhiqiang2
（1. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，Haikou 570101；2. Haikou Experimental Station，Institute of Banana，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 570101）

ASR gene was obtained from banana cDNA libraries in this study and ws named as MaASR. Phylogenetic analysis revealed MaASR was close relatives to Musaceae of Monocotyledons. Endogenous ABA content was determined in naturally ripened bananas and ethylenetreated bananas. In naturally ripened bananas, endogenous ABA content is relatively low at mature early（0-2 d）, and increase maximum at 8 day, then drop rapidly. In ethylene- treated bananas, ABA content rise sharply peak at 3 days and then gradually decline. Real-time quantitative PCR analysis expression of MaASR in naturally ripened bananas and ethylene- treated bananas. In naturally ripened bananas, MaASR expression increased and peaked 2 days after harvest, then fell rapidly and remained low at 6-16 d. While in ethylene- treated bananas, MaASR expression levels do not show the dramatic change trend, the expression is overall low. The results showed that MaASR was responding to ethylene signal, but response intensity is low, its expression trend was negatively correlated with the content of ABA or signal strength.

Banana ASR gene Characteristic Expression analysis

2013-10-16

國家自然科學基金項目（31071788），‘十二五’農村領域國家科技計劃課題（2011AA10020605），現代農業產業技術體系建設專項資金資助項目（CARS-32）

賈彩紅，女，副研究員，碩士，研究方向：香蕉分子生物學；E-mail：jiach9@163.com

金志強，男，研究員，博士生導師，研究方向：香蕉分子生物學；E-mail：18689846976@163.com