香菇dsRNA病毒LeV的RT-PCR檢測

香菇dsRNA病毒LeV的RT-PCR檢測

郭杰1，2吳小平1
（1.福建農林大學生命科學學院，福州 350002；2.三門峽農業科學研究院，三門峽 472000）

香菇病毒HKB（Lentinula edodes mycovirus HKB，LeV）是一種具有潛隱性特點的真菌病毒，廣泛存在于香菇菌株中。為了快速、準確地檢測出LeV，根據LeV病毒基因組序列（AB.429556.2）的信息，設計合成一對引物，對25個香菇菌株進行RTPCR檢測，在20個香菇菌株中分別擴增出LeV病毒基因組特有的條帶，在5個香菇菌株中未能擴增出條帶。通過對25個香菇菌株進行dsRNA提取檢測，結果也表明不存在擴增片段的菌株提取不到dsRNA，存在擴增片段的菌株能夠提取得到dsRNA。因此建立的RT-PCR方法可以快速檢測到香菇dsRNA病毒LeV，能夠對香菇的質量檢測提供技術支持。

dsRNA 真菌病毒 RT-PCR 香菇

香菇病毒HKB（Lentinula edodesmycovirus HKB，LeV），存在于多數感染病毒的香菇中。最近有報道檢測到一條與其基因組相關的dsRNA，分子大小為11 282 bp，編碼兩個閱讀框ORF1和ORF2，ORF1編碼一個假定蛋白，ORF2推測編碼RNA依賴的RNA聚合酶［1］。LeV是一種真菌病毒，具有潛隱性的特點，在生產過程中人們不易辯認和排除［2］。通常感染病毒的香菇可以完成自身正常的生命周期，病毒在很長的時期內不會產生明顯的癥狀，但也會偶爾出現異常癥狀。如基質表面白色絨毛菌絲生長不足或轉色不完全［3］，子實體畸型等，這些癥狀往往導致嚴重的經濟損失。因此，為滿足香菇菌株質量檢測和無毒化生產的需要，本試驗根據LeV基因序列，擬建立快速、簡單的RT-PCR方法用于香菇病毒LeV感染的檢測診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 香菇菌株236，Cr33，慶科20，春菇一號，香安，9319，L0200，L0205，L0213，L0228，L0232，L0284，L0312，L0318，L0327，L0328，L0334，L0364，L0368，L0391，L0610，L0612，L0617，L0620，感染LeV的菌株L0183［4］均為福建農林大學菌物研究中心保存。

1.1.2 培養基 PDA 培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖

20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

PDB培養基 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，H2O 1 000 mL。

1.1.3 主要試劑 RT試劑，DNaseⅠ和S1 Nuclease購自Fermentas公司；PCR試劑，pMD18-T，E.coliDH5α購自TaKaRa公司；Trizol試劑盒購自Invitrogen公司；其它試劑均為國產。根據LeV的ORF2序列信息（GenBank：AB.429556.2）設計1對引物：LeVY-02-S：5'-ACAGTAGCGGTATCTCA-3'，LeVY-02-A：5'-GCCAGGCAGTTTAGT-3'。

1.2 方法

1.2.1 菌絲體的制備 供試香菇菌種轉接于試管中活化（含PDA培養基），滿管后轉接于500 mL三角瓶中（含200 mL PDB培養基），25℃下靜置培養15 d，過濾收集菌絲體，用濾紙吸干，-20℃保存備用。

1.2.2 香菇dsRNA和RNA的提取 供試菌株dsRNA和RNA的提取方法分別參照dsRNA技術［4］和Trizol試劑盒操作說明書。

1.2.3 香菇dsRNA病毒RT-PCR檢測反應體系 RT反應體系，首先在0.2 mL PCR管中加入RNA模版（100 ng），10 μmol/L引物LeVY-02-A 1 μL，二甲亞砜1 μL，補DEPC水至10 μL，100℃保溫5 min，然后迅速放置冰上5 min。再添加5×RT Buffer 4 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、40 U/μL Rnase inhibitor 0.5 μL、200 U/μL 反轉錄酶M-MuLV 0.5 μL、用DEPC水補充至20 μL，反應總體積為20 μL，反應程序為42℃反應1 h，70℃滅活10 min立刻置于冰上，-20℃保存。

RT反應結束后取1 μL RT產物進行PCR反應，添加10×PCR Buffer 3 μL（含15 mmol/L MgCl2），2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μLTaqDNA聚合酶 0.3 μL、10 μmol/L引物（LeVY-02-S，LeVY-02-A）各1 μL，用DEPC水補充至30 μL，反應總體積為30 μL，反應程序為95℃預變性5 min，95℃ 45 s，最佳退火溫度52℃ 45 s，72℃ 45 s，25個循環，72℃延伸10 min。

1.2.4 病毒核酸類型鑒定 利用DNaseⅠ和S1 Nuclease鑒定該病毒基因組的核酸類型，分別參照DNaseⅠ和S1 Nuclease的操作說明書。

1.2.5 RT-PCR產物的克隆和測序 瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產物后，隨機選取3個菌株擴增的目的片段經PCR Fragment Recover Kit回收純化，與pMD18-T Vector連接后轉化E.coli.DH5α菌株感受態細胞，挑取陽性克隆子，菌落PCR驗證后，送上海生工生物工程公司進行測序，測序結果運用NCBI Blast進行同源性搜索比較分析。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測

LeVY-02引物RT-PCR結果（圖1）表明，在25個香菇菌株中，236、L0200、L0328、L0284、L0620菌株不存在特異性目的片段，其余菌株均存在一條大小約434 bp的特異性目的片段。因此，236、L0200、L0328、L0284、L0620菌株中不含有香菇真菌病毒，其余20個菌株中可能含有香菇真菌病毒LeV。

圖1 RT-PCR檢測香菇真菌病毒LeV的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.2 序列分析

L0183、L0232、L0617菌株RT-PCR擴增的目的片段克隆測序后，結果（圖2）表明3個片段的序列分別與LeV（AB.429556.2）對應序列的相似性為 98%（L0232）、99%（L0183）、99%（L0617）。由此，可以認為存在擴增片段的20個菌株中含有香菇真菌病毒LeV，但其dsRNA可能有差異。

圖2 多序列比對結果

2.3 病毒核酸類型

經過DNaseⅠ和S1 Nuclease鑒定該病毒基因組的核酸類型為dsRNA（圖3）。通過dsRNA的提取結果也表明不存在擴增片段的菌株提取不到dsRNA，存在擴增片段的菌株能夠提取得到dsRNA。

圖3 香菇真菌病毒LeV基因組瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

通常dsRNA病毒可以通過電子顯微鏡進行病毒顆粒的檢測［5-8］，但是電鏡檢測需要的樣品量大，過程復雜且靈敏度相對較低，對于一些特殊的病毒，電鏡也無法進行檢測。已有研究表明，LeV是一種線性真菌病毒，通過電子顯微鏡沒有發現同dsRNA相關的病毒顆粒，通過原子力顯微鏡才獲得了病毒的分子成像［1］，但昂貴的設備，更高要求的檢測方法令一般的研究單位難以負擔。dsRNA病毒還可以通過提取病毒基因組進行檢測［9-11］，但傳統的dsRNA提取技術檢測香菇病毒，經常性地出現雜帶影響或提取不到dsRNA［4］。RT-PCR檢測是一種常規的檢測技術，在動植物病毒檢測方面已有多篇報道［12-14］，在食用菌dsRNA病毒檢測中也有相關報道［15，16］，但在國內尚未見利用RT-PCR對香菇病毒HKB（LeV）檢測的報道。經過LeV的RT-PCR檢測試驗證實，RT-PCR方法較其他檢測方法，不需要特殊且貴重的儀器設備，也無需活性病毒，只要存在未降解的核酸片段，且達到檢測的最低病毒量就

能夠檢測，具有操作簡單，快速、靈敏性高的特點，可以避免提取病毒顆粒和基因組等檢測方法操作繁瑣或效果不理想等問題。

香菇LeV病毒RT-PCR檢測方法還需要繼續完善，如進行RT-PCR方法的優化試驗，提高檢測的經濟性；或開發具有熒光素標記或其他發光物質標記的RT-PCR，提高檢測結果的可視性；或在香菇病毒分子生物學的深入研究下，完成病毒基因組的全序列分析，建立核酸分子雜交檢測方法，免疫學血清檢測方法，酶聯免疫吸附檢測方法和蛋白質微列陣檢測方法等，開發出簡便、靈敏的病毒檢測試紙條，無論是在研究上或應用上都具有廣泛的現實意義。

4 結論

建立了一種可對香菇LeV病毒核酸進行擴增的RT-PCR方法，適用于香菇LeV病毒的診斷和快速檢測。

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（責任編輯 李楠）

RT-PCR Detection of dsRNA Virus LeV in Lentinula edodes

Guo Jie1，2Wu Xiaoping1
（1. College of Life Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002；2. Institute of SanMenxia Agriculture Science，Sanmenxia 472000）

Lentinula edodes mycovirus HKB（LeV）is a fungal virus with the potential symptoms and exists widely in Lentinula edodes strains. In order to detect LeV from abundant strains rapidly and accurately, a pair of primers were designed according to the sequence of LeV（AB.429556.2）and amplified by RT-PCR method. In a total of 25 strains, 20 strains were positive for LeV and 5 strains were negative. The result of dsRNA extraction also showed dsRNA were obtained in the positive strains and the negative strains were not. In conclusion, the study proved that RT-PCR is a rapid and sensitive method for detection of LeV in Lentinula edodes strains and can attribute to the control of strains quality.

dsRNA Mycovirus RT-PCR Lentinula edodes

2013-09-23

福建省科技廳自然科學基金項目（2013J01080）

郭杰，男，助理農藝師，碩士，研究方向：食用菌病害；E-mail：gjfywx_2008@163.com

吳小平，男，教授，博士，研究方向：食用菌教學與科研；E-mail：fjwxp@126.com