淡色生赤殼菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1菌株產生抗菌物質的發酵條件優化

淡色生赤殼菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1菌株產生抗菌物質的發酵條件優化

劉琴英 蔣冬花 齊育平 孫蕾 陳璨 謝祥聰
（浙江師范大學 化學與生命科學學院，金華 321004）

以淡色生赤殼菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1菌株發酵液乙酸乙酯粗提物對水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）抑菌活性為檢測指標，采用單因素試驗優化Bo-1菌株產生抗菌物質培養所需的碳源、氮源、無機鹽；通過正交試驗優化培養基配方和搖瓶發酵條件。研究結果表明，Bo-1菌株產生抗菌物質適宜的碳源、氮源和無機鹽分別為淀粉、蛋白胨、MgSO4·7H2O；優化的培養基配方為：淀粉30 g/L，蛋白胨2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L；適宜的發酵條件為：溫度30℃，轉速150 r/min，裝液量80 mL/250 mL，pH 6.5。

淡色生赤殼菌 正交試驗 發酵 優化 抑菌活性

植物內生真菌（endophytic fungus）是指那些在其生活史中某一段時期生活在活的植物組織內、不引起植物組織產生明顯病害癥狀的真菌［1］。研究發現，寄生在植物體內的內生真菌可以產生多種活性物質，如吡咯烷類生物堿、麥角堿、吲哚二萜等活性物質，可以提高植物的抗病菌、抗線蟲的能力，如Istifadah等［2］研究發現，將內生真菌球毛殼菌（Chaetomium globosum）接種到小麥后，能夠減輕由小麥德氏霉（Drechslera tritici-repentis）引起的小麥黃斑葉枯病的癥狀。因此，植物內生真菌具有作為新型抗菌藥物篩選源的巨大潛力［3］。

生 赤 殼 屬（Bionectria） 是1999年Rossman等［4］根據形態學及分子生物學特征將一部分叢赤殼科（Nectriaceae）菌種獨立出來建立的一個屬，被歸類為生赤殼科（Bionectriaceae），肉座菌目（Hypocreales），子囊菌綱（Ascomycetes），子囊菌門（Ascomycota）。據相關研究報道，某些生赤殼菌（Bionectriaspp.）所產生的抗生素類物質可以對某些病原菌起特異性拮抗作用，如曹晉忠［5］從黃芩內分離出的淡色生赤殼菌N.SBA35對枯草芽孢桿菌

（Bacillus subtilis）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、鐮孢霉（Fusarium）等具有較好抑菌效果。

本實驗室以水稻白葉枯病菌（Xoo）P6生理小種為指示菌，篩選得到一株對其抑菌效果明顯的水稻內生真菌淡色生赤殼菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1菌株。此外，其發酵液乙酸乙酯粗提物對大腸桿菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Monilia albican）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）等也有較強抑菌活性。本研究以Bo-1菌株對白葉枯病菌的抑菌活性為檢測指標，優化發酵工藝以期提高發酵液中抑菌活性物質的含量，并測定其次級代謝產物的最低抑菌濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 淡色生赤殼菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1菌株由本實驗室從浙江省金華市水稻田健康水稻葉片內分離獲得，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO：M 2013027。

1.1.2 供試病原菌 水稻白葉枯病菌（Xoo）P6生理小種，由浙江師范大學生化學院遺傳實驗室提供。

1.1.3 主要培養基 馬鈴薯葡萄糖蛋白胨培養基（PDP）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1.0 g，水1 000 mL，pH6.0-6.5，（固體培養基加瓊脂粉18 g）；用于Bo-1菌株的培養與優化。

改良PD培養基：馬鈴薯300 g，蛋白胨5.0 g，蔗糖15.0 g，Ca（NO3）2·4H2O 0.5 g，NaHPO4· 12H2O 2.0 g，水1 000 mL，pH6.0-6.5，（固體培養基加瓊脂粉18 g）；用于XooP6生理小種的培養。

1.2 方法

1.2.1 Bo-1菌株發酵液粗提物的制備 采用液體發酵的方法，挑取已純化菌絲體接種到裝有約100 mL PDP液體培養基的250 mL錐形瓶中，于搖床上（220 r/min、28℃）振蕩培養。培養約7 d后，獲得發酵液。所得發酵液在室溫下經紗布過濾后得濾液，濾液經乙酸乙酯萃取多次，直至上層乙酸乙酯層無色為止。將得到的乙酸乙酯層溶液合并，在旋轉蒸發儀上蒸發濃縮至干即得Bo-1菌株發酵液粗提物。

1.2.2 Bo-1菌株抑菌活性的生物測定 參照文獻［6，7］，用牛津杯法測定發酵液粗提物對白葉枯病菌拮抗活性，具體操作如下：取保藏于-80℃冰箱XooP6生理小種接種于改良PD液態培養基搖床活化培養（120 r/min，28℃），當菌懸液濃度達到OD值0.6時，取100 μL菌液均勻涂布到PDA固體培養基上，待用；把發酵液粗提物用乙酸乙酯稀釋成濃度為200 μg/mL的藥液，待用；采用牛津杯法測定抑菌效果，用十字交叉法測量抑菌圈的大小。以乙酸乙酯溶液作為空白對照，每處理重復3次（以下所有試驗均重復3次）。

1.2.3 發酵培養基優化

1.2.3.1 碳源優化 采用單因素試驗［8］以PDP為基礎培養基，將其中的碳源依次替換為蔗糖、乳糖、甘油、麥芽糖、淀粉，以基礎培養基為對照。培養7 d后，按1.2.1方法處理發酵液，測定發酵液粗提物的抑菌活性。

1.2.3.2 氮源優化 采用單因素試驗［8］以PDP為基礎培養基，將其中的氮源依次替換為硝酸銨、胰蛋白胨、尿素、硝酸鉀、牛肉浸膏，以基礎培養基為對照。培養7 d后，處理發酵液，測定發酵液粗提物的抑菌活性。

1.2.3.3 無機鹽優化 以優化的碳、氮源培養基作為對照，根據微生物對大量元素與微量元素的利用情況不同，按0.5 %的量分別加入NaCl和K2HPO4，按0.05%的量分別加入MgSO4·7H2O和CaCl2，按0.000 5% 的量分別加入FeSO4·7H2O，ZnSO4和CuSO4。培養7 d后，處理發酵液，按測定發酵液粗提物的抑菌活性。

1.2.3.4 培養基配方正交優化 在上述單因子篩選的基礎上，以淀粉、蛋白胨、MgSO4·7H2O為考察因素，設置3個水平，用L9（34）正交設計試驗（表1）［9］。培養7 d后，處理發酵液，測定發酵液粗提物的抑菌活性。

1.2.4 發酵條件正交優化 采用優化后的培養基，以裝液量、初始pH、培養溫度、搖床轉速為考察因素，每個因素設計4個水平，用L16（45）正交設計試驗（表2）［9］。培養7 d后，處理發酵液，測定發酵液粗提物的抑菌活性。

表 1 發酵培養基正交試驗的因素和水平設計

表 2 發酵條件正交試驗的因素和水平設計

1.2.5 優化驗證試驗 將活化后的Bo-1菌株分別接種到優化后培養基和原始培養基中，并對應采用優化后的培養條件和原始條件進行發酵。培養7 d后，處理發酵液，測定發酵液粗提物的抑菌活性。

1.2.6 最低抑菌濃度測定（MIC） 使用優化后的培養基及條件進行發酵，制備發酵液粗提物，稱取一定質量的該粗提物溶于乙酸乙酯中，對倍稀釋配制濃度分別為2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 μg/mL的藥液，瓊脂稀釋法［10，11］測定Bo-1菌發酵液粗提物對白葉枯病菌的MIC。以原始培養基及條件發酵所得的發酵液粗提物作為對照。

2 結果

2.1 發酵培養基優化

2.1.1 Bo-1菌株發酵的碳源優化 由表3可知，不同碳源對Bo-1菌株發酵液粗提物抑菌活性強弱明顯不同。其中，以淀粉為碳源時，發酵液粗提物抑菌活性最強，抑菌圈直徑達34.2 mm；其次蔗糖，抑菌圈直徑為29.1 mm；在所有供試的碳源中，甘油最不適合該菌株產生抗菌物質，所得抑菌圈直徑僅18.3 mm。由此可見，選用淀粉作為碳源最有利于Bo-1菌株產生抗菌物質。

2.1.2 Bo-1菌株發酵的氮源優化 由表4知，以不同氮源替代基礎培養基蛋白胨后，其發酵液粗提物抑菌活性均不如蛋白胨（28.9 mm）。但各氮源間還是存在一定差異，牛肉浸膏僅次于蛋白胨，抑菌圈直徑為27.5 mm；接著依次為胰蛋白胨、硝酸銨、硝酸鉀、尿素。因此，選擇蛋白胨作為氮源最有利于Bo-1菌株產生抗菌物質。

表 3 碳源對Bo-1菌株發酵液粗提物抑菌活性的影響

表 4 氮源對Bo-1菌株發酵液粗提物抑菌活性的影響

2.1.3 無機鹽對Bo-1菌株發酵的影響 在優化后的碳、氮源培養基中，分別加入不同無機鹽培養Bo-1菌株，所得發酵液粗提物抑菌活性有顯著差異（表5）。與基礎培養基相比，加入無機鹽后，Bo-1菌株發酵液粗提物抑菌活性出現促進、抑制、無影響3種情況。當加入MgSO4·7H2O時，其抑菌能力略有升高，抑菌圈直徑為37.6 mm（對照34.2 mm）；當加入CuSO4和ZnSO4時，其抑菌活性顯著下降，抑菌圈直徑分別為22.1 mm、25.5 mm。其余4種無機鹽（NaCl、K2HPO4、CaCl2、FeSO4·7H2O）的加入，對其抗菌活性均無明顯影響。由此可見，在基礎培養基中加入MgSO4·7H2O有利于Bo-1菌株產生抗菌物質。

2.1.4 優化的發酵培養基配方 正交優化試驗結果見表6，由極差R值的大小可以看出，培養基配方的3種組分對Bo-1菌株抑菌活性能力影響的主次順序為：B（蛋白胨）＞A（淀粉）＞C（MgSO4·7H2O）。對正交試驗進行方差分析（表7）發現，僅B因素的P值小于0.05，因此，僅B因素對試驗具有顯著性的影響；F值由大到小依次為B＞A＞C，F數值越大表明該因素的變化對結果影響越大。由此可知，對Bo-1菌株發酵液粗提物抑菌活性的影響順序為B、A、C，這與直觀分析結果基本一致。綜上分析，確定Bo-1菌株優化的發酵培養基配方為A1B1C2即淀

粉30 g/L，蛋白胨2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

表 5 無機鹽對Bo-1菌株發酵液粗提物抑菌活性的影響

表 6 培養基配方正交試驗結果

表 7 培養基配方正交試驗方差分析

2.2 發酵條件的優化

從表8可以看出，發酵條件對Bo-1菌株發酵液粗提物抑菌活性有顯著影響。由極差R值分析可見，4種因素對Bo-1菌抑菌活性能力影響的強弱順序為：C（裝液量）＞A（溫度）＞B（轉速）＞D（pH）。裝液量對其活性影響最顯著，并與其活性呈負相關；pH對其活性影響最為微弱。對正交試驗進行方差分析（表9）知，F值由大到小依次為C（裝液量）＞A（溫度）＞B（轉速）＞D（pH），這與直觀分析結果基本一致。因此，最優發酵條件組合：A3B2C3D1即溫度30℃，轉速150 r/min，裝液量80 mL/250 mL，pH6.5。

表 8 發酵條件正交試驗結果

表 9 發酵條件正交試驗方差分析

2.3 優化驗證試驗結果

采用優化過的培養基和條件發酵Bo-1菌株，其抑菌活性較原始抑菌活性（29.3 mm）顯著增強，抑菌直徑達42.5 mm（圖1）。

圖 1 優化驗證試驗結果

2.4 最低抑菌濃度測定（MIC）

較原始Bo-1菌株發酵液粗提物對白葉枯病菌的MIC（250 μg/mL），優化后的MIC值有了顯著的下降，其值僅為125 μg/mL。

3 討論

微生物的發酵受外部環境條件的影響較大，不同的環境條件往往使得微生物具有不同的生長狀態和不同的代謝途徑，從而產生出不同的代謝產物［12］。在前期的研究中篩選得到了一株具有較強拮抗水稻白葉枯病菌活性的淡色生赤殼菌Bo-1菌株，本研究對其進行了一系列發酵條件優化試驗，從而得到Bo-1菌株產生抗菌物質的最優培養條件，Bo-1菌株抑菌活性（42.5 mm）比優化前（29.3 mm）提高了45.1%。類似的報道，如胡小媛等［13］通過單因子法及響應面法優化布拉酵母培養基及培養條件，經驗證發現，該菌在優化后的條件下培養，菌體濕重（32.2 g/L）比優化前（20.9 g/L）提高了54.1%，而活菌數（8.3×108CFU/mL）比優化前（5.5×108CFU/mL）提高50.9%；劉冬梅等［14］通過單因素試驗與正交試驗法相結合，優化Lactobacillus caseisubsp. rhamnosus LCR 719培養基配方及發酵條件后，其對S. aureus抑菌圈直徑達42 mm，對枯草芽孢桿菌和腸炎沙門氏菌也有較好的抑菌效果。

4 結論

在優化條件下，Bo-1菌發酵液粗提物抗菌活性有了較大的提高，抑菌圈直徑達42.5 mm，對水稻白葉枯病菌的MIC為125 μg/mL。

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（責任編輯 李楠）

Fermentation Optimization of Antimicrobial Substance Produced by Bionectria ochroleuca Strain Bo-1

Liu Qinying Jiang Donghua Qi Yuping Sun Lei Chen Can Xie Xiangcong
（College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004）

Based on the index of antimicrobial activity of ethyl acetate extracts from culture liquid of Bionectria ochroleuca strain Bo-1 to Xanthomonas oryzae pv. oryzae, the optimal carbon source, nitrogen source and salt for the production of antimicrobial substance by strain Bo-1 were tested by single factor experiments. The medium composition and fermentation conditions were optimized by orthogonal experiments. The results showed that the optimal carbon source, nitrogen source and salt were starch, peptone, MgSO4·7H2O, respectively. The optimal composition of the medium was 30 g/L starch, 2 g/L peptone, 0.5 g/L MgSO4·7H2O. The optimal fermentation conditions were the combination of temperature 30℃, agitation speed 150 r/min, medium volume 80 mL/250 mL, initial pH6.5.

Bionectria ochroleuca Orthogonal experiments Fermentation Optimization Antimicrobial activity

2013-07-29

國家自然科學基金項目（31270061）

劉琴英，女，碩士研究生；研究方向：應用微生物學；E-mail：rk371970746@163.com

女，教授，碩士生導師，研究方向：微生物學和植物病理學；E-mail：jdh@ zjnu. cn