高溫短程反硝化菌Brevibacillus sp.XF-03特性及其降解動力學

高溫短程反硝化菌Brevibacillus sp.XF-03特性及其降解動力學

郝敏娜 楊云龍 葛啟隆
（太原理工大學環境科學與工程學院，太原 030024）

采用梯度馴化方法，使得菌株Brevibacillus sp.XF-03在高溫（50℃）條件下，能夠降解1 000 mg/L亞硝態氮，并通過單因素試驗對其生長碳源和C/N進行優化，結果顯示，菌株Brevibacillus sp.XF-03短程反硝化最適碳源為琥珀酸鈉，C/N為12∶1。在此最佳條件下，42 h對初始濃度為100 mg/L亞硝態氮去除率為95.1%。對該菌株亞硝態氮降解動力學過程進行模擬，符合基質抑制型的 Haldane 模型，各參數分別為：最大比降解速率（μmax）=1.28 h-1，半飽和常數（KS）=451.42 mg/L，底物抑制常數（Ki）=176.77 mg/L。初步探討了亞硝酸鹽還原酶（NIR）活性，在該菌株生長指數期的后期，亞硝酸鹽還原酶比活力達0.279（U/ mg protein）。

Brevibacillus sp.XF-03 高溫 短程反硝化 亞硝態氮降解動力學 酶活性

隨著工業化的發展，水體富營養化現象日趨嚴重，去除水中氮素污染已成為當今水污染防治領域的一個熱點問題［1，2］。目前普遍認為生物脫氮是從污水中去除氮素污染的經濟有效的方法之一［3，4］。在諸多污水脫氮新技術中，應用廣泛、發展較快及最經濟高效的有短程硝化反硝化、同步硝化反硝化及厭氧氨氧化等，它們因具有節省曝氣量、提高反應速率、節約碳源、縮短反應時間等優點［5］，越來越受到人們的重視［6，7］，實現這些新技術的關鍵是獲得具有較高脫氮能力的微生物。此外，以上新技術多適用處理中低溫環境的污水［8，9］，若處理高溫污水則需對污水進行降溫，這給生物法處理高溫污水帶來較大困難。

本文研究菌株Brevibacillussp.XF-03的高溫短程反硝化特性及其亞硝態氮降解動力學，以期為短程硝化反硝化工藝的應用以及傳統反硝化過程中亞硝

態氮積累問題的解決提供技術參數與新的菌源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株：Brevibacillussp.XF-03，來源于太原理工大學環境科學與工程實驗室，經鑒定為短芽孢桿菌屬（Brevibacillussp.），GenBank登錄號為 KF052620。試驗初步證明在高溫條件（50℃）下，該菌具有較好的短程反硝化能力。

1.1.2 培養基 LB富集培養基（g/L）：胰蛋白胨10；酵母浸出粉 5；NaCl 10；pH7.0-7.5。

短程反硝化培養基（g/L）：NaNO2適量；KH2PO41.5；Na2PO4·7H2O 7.9；MgSO4·7H2O 0.1；琥珀酸鈉適量；微量元素溶液2 mL；pH 7.0-7.5。

微量元素溶液成分（g/L）：EDTA 50.0；ZnSO42.2；CaCl25.5；MnCl2·4H2O 5.06；FeSO4·7H2O 5.0；（NH4）6Mo7O2·4H2O 1.1；CuSO4·5H2O 1.57；CoCl2·6H2O 1.61；pH7.0-7.5。

以上培養基121℃高壓滅菌20 min，固體平板和斜面培養基均在上述培養基中加入1.8%的瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 菌株Brevibacillus sp.XF-03的短程反硝化馴化 將本實驗室保藏的菌株Brevibacillussp.XF-03接種至裝有LB培養液的三角瓶中，30℃，160 r/min搖床振蕩活化2代，并將次級培養物活化至細菌對數生長期，作為接種體使用。取活化后的菌液10 mL，接入裝有100 mL培養液的三角瓶中，搖床恒溫振蕩。以琥珀酸鈉作為唯一碳源和能源，利用NO2

--N作為唯一氮源，采用梯度馴化的方法首先對細菌進行升溫培養。馴化培養過程按10%梯度接種的方法，溫度梯為：30℃→35℃→40℃→43℃→46℃→48℃ →50℃。菌株在50℃下生長穩定后，再對其進行亞硝態氮濃度梯度馴化。亞硝態氮濃度梯度增加依次為：50、100、150、 200 、300、400、500、600、700、800、1 000 mg/L。同時，在馴化的過程中定期監測水質并觀察微生物的生長情況。

1.2.2 菌株Brevibacillussp.XF-03短程反硝化條件優化 將處于對數生長期的菌液接入100 mL短程反硝化培養基中，通過調節碳源（葡萄糖、苯酚、酒石酸鉀鈉、檸檬酸鈉、乙醇、琥珀酸鈉）和 C/N（3∶1，6∶1，9∶1，12∶1，15∶1，20∶1），50℃、160 r/min搖床振蕩培養，定期測定培養液中菌體生長量與NO2

--N含量。考察碳源與碳氧化（C/N）對菌株Brevibacillussp.XF-03生長及短程反硝化能力的影響，每組試驗設3個重復。

1.2.3 短程反硝化動力學研究 在最佳試驗條件下，應用Haldane方程對菌株生長和亞硝態氮降解特性進行動力學研究［10］。為用回歸曲線求出準確的動力學方程，動力學試驗在較寬的NO2--N含量范圍內進行，即0-1000 mg/L。NO2--N濃度選擇如下：0-200 mg/L之間，每40 mg/L一個濃度梯度；200-600 mg/L之間，每100 mg/L一個濃度梯度；600-1000 mg/L之間，每200 mg/L一個濃度梯度。將菌懸液分別接種到裝有上述不同初始NO2--N濃度的短程反硝化培養基中，搖瓶振蕩培養，每隔適宜時間取樣檢測培養液中的菌體含量和殘余NO2--N含量。

1.2.4 粗酶液的提取 將處于不同生理時期的菌液離心（8 000 r/min，10 min），棄去上清液，收集菌體，用0.01 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH7.2）清洗后重懸細胞，再次離心，重復3次，留取菌體沉淀。按原菌液體體積的1/5-1/10加入裂解液，制成懸浮菌液，裂解液的成分為：pH8.0的50 mmol/L Tris-HCI緩沖液、2 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，置于冰水浴中超聲破碎。破碎液于12 000 r/min，4℃離心20 min，收集上清液即為粗酶［11］，低溫保存待用。

1.2.5 菌體OD600測定 可見分光光度法，細胞干重采用干燥恒重法測量，根據細胞干重標準曲線將吸光度轉換為細胞干重［12］；亞硝態氮測定：N-（1-萘基）-乙二胺光度法［13］；亞硝酸鹽還原酶（NIR）活力測定：測定系統總體系3 mL，內含1.0 mL Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH7.2），1 mL粗酶液以及1 mL 0.01 mol/L的亞硝酸鈉溶液，試劑全部加入后立即取適量上述混合液，測340 nm處的吸光度，剩余待測液在常溫靜置20 min后測其340 nm處的吸光度［14］。定義亞硝酸鹽還原酶（NIR）活力單位（U）為每分鐘轉化1 μmol亞硝酸鹽氮所需酶量。總蛋白含量用Bradford法測定［15］，酶的比活力以每毫克蛋白質中所含酶的活力單位數計算。試驗數據分析借助Matlab軟件。

2 結果

2.1 碳源對菌株Brevibacillus sp.XF-03短程反硝化影響

圖1為不同碳源情況下，42 h后菌株各自生長及NO-

2-N降解情況。由圖1可以看出菌株Brevibacillussp.XF-03短程反硝化的順利進行對碳源有一定的選擇性。該菌幾乎不能以乙醇、苯酚、酒石酸鉀鈉作為唯一碳源生長；而對葡萄糖而言，菌體在其中所需的適應階段較長，亞硝態氮降解也不充分，可能是由糖類物質降解過程的復雜性引起的。分別以檸檬酸鈉和琥珀酸鈉為碳源時，菌株Brevibacillussp.XF-03均能較好地生長，與以檸檬酸鈉為碳源相比，當以琥珀酸鈉為碳源時，亞硝態氮降解率較高42 h亞硝態氮由100 mg/L降解到5.9 mg/L，降解率達94.1%，說明琥珀酸鈉為該菌株的最適碳源。

圖1 碳源對菌體生長及NO-2-N降解的影響

2.2 碳氮化對菌株Brevibacillus sp.XF-03短程反硝化影響

以琥珀酸鈉為唯一碳源，亞硝酸鈉為唯一氮源，固定碳源含量，通過調節亞硝酸鈉含量控制碳氮比。由圖2可知，當碳氮化（C/N）小于12時，亞硝態氮去除率及菌株生長情況隨著C/N增加而提高，C/N大于12時，亞硝態氮去除率及菌株生長情況趨于平緩，提高不明顯。綜合考慮，確定菌株Brevibacillussp.XF-03的最適碳氮比為12∶1。

2.3 菌株Brevibacillus sp.XF-03短程反硝化特性

圖2 碳氮比（C/N）對菌體生長及NO2--N降解的影響

在最適碳源及碳氮比，培養液初始NO-2-N濃度為100 mg/L條件下，菌株Brevibacillussp.XF-03生長及亞硝酸鹽降解曲線如圖3。經18 h的適應期后菌株Brevibacillussp.XF-03進入對數生長期，在該時期內，短程反硝化作用明顯加強，因為這個時期（18-36 h）是細菌生長和繁殖最旺盛的時期，細胞合成所需要的能量和還原力主要在這一階段被消耗，因此反硝化作用主要在這一時段內完成。培養42 h，NO-

2-N從100 mg/L降 至4.90 mg/L， 去 除 率 為95.1%。在對數期后期，有效細菌的數目雖逐漸減少，而亞硝酸鹽仍有少量降低，此時很可能是細菌的同化起主要作用。

圖3 菌株Brevibacillus sp.XF-03生長曲線及亞硝態氮變化

2.4 亞硝態氮降解動力學

短程反硝化菌在以亞硝酸鹽氮為底物進行反硝化的過程中，亞硝態氮對微生物有一定的毒害作用，當其濃度達到一定值時，也會對反硝化過程產生抑制，導致反應速率下降，因此建立動力學模型時，需要選擇一種非競爭性底物抑制模型，已經有多種底物抑制模型被建立，其中Haldane模型是最常見的模型，定義如下式：

μ=μmaxC/（Ks+C+C2/Ki） （1）

式中，μ為底物比降解速率（h-1）；μmax為最大比降解速率（h-1）；C為底物初始濃度（mg/L）；KS

為半飽和常數（mg/L）；Ki為底物抑制常數（mg/L）。

試驗假定亞硝態氮是菌株Brevibacillussp.XF-03比生長速率的單一限制性底物，搖瓶中的溶氧為常數且為非限制性因素。對于每一個初始亞硝態氮濃度（C），比生長速率（μ） 由指數生長期決定。對每一個搖瓶指數生長期的菌體濃度和時間的半對數圖做線性最小二乘擬合得，在指數生長期，μ 約為一個常數。

運用Matlab軟件處理試驗數據，得到亞硝酸鹽抑制動力學方程式（2）。模型相關性系數R2為0. 992，說明擬合曲線與試驗實測值相關性良好。

μ=1.28C/（451.42+ C+C2/176.77） （2）

模擬曲線如圖4所示。底物比降解速率（μ）隨著亞硝態氮初始濃度的增加呈現先增大后減小的趨勢，這是典型的抑制生長模式，最大比降解速率發生在亞硝態氮濃度為282.48 mg/L處，隨著初始亞硝態氮濃度的繼續增加，其比降解速率逐漸減小，在這一過程中，亞硝態氮抑制作用占主導。此外，反應體系中代謝物的積累也是造成亞硝態氮比降解速率下降的原因之一。

圖4 亞硝酸鹽氮降解動力學擬合曲線

2.5 酶活性的測定

以琥珀酸鈉為碳源，C/N=12，初始亞硝態氮濃度為282.48 mg/L，研究菌株Brevibacillussp.XF-03亞硝酸鹽還原酶活性。由圖5可知，菌株Brevibacillussp.XF-03在生長停滯期，亞硝酸鹽還原酶活性較低，亞硝態氮降解率僅有12.56%，在其生長指數期的后期，產生大量亞硝酸鹽還原酶，且亞硝酸鹽還原酶的比活力達到最大值0.279（U/mg protein），亞硝態氮降解速率提高，說明脫氮過程中菌株不同生長階段亞硝態氮還原酶的活力不同，亞硝酸鹽還原酶是短程反硝化菌降解亞硝態氮的關鍵酶。

圖5 菌體生長，亞硝態氮降解及亞硝態氮還原酶比活力變化曲線

3 討論

反硝化微生物大多數需要碳源作為電子供體，具有較廣泛的碳源譜，碳源的種類影響到反硝化強度［16］。Martienssen等［17］認為有機碳源的數量和種類是影響反硝化微生物菌落結構的重要因素之一，這與本研究結論一致。同時，研究表明碳氮比也是影響微生物脫氮效果的重要因素之一，低碳氮比條件下，NO-2和N2O均可利用內碳源進行反硝化，氧化亞氮還原酶競爭電子的能力較弱，反硝化過程出現N2O積累。碳源充足，亞硝態氮還原酶和氧化亞氮還原酶同時利用外碳源進行反硝化，初始階段產生的N2O在接下來的反硝化過程中被迅速還原為N2［18］。碳源不足，反硝化速率降低；碳源過量雖可提高系統反硝化脫氮能力，但增加了碳源消耗，同時也增加了耗氧量。

目前，已發現多種反硝化菌，主要分布于Pseudomonas、Alcaligenes和Bacillus三個屬［19］。對反硝化微生物的研究主要集中于以硝酸鹽氮為電子受體的反硝化菌，對亞硝酸型反硝化菌的研究集中在混合菌反應器運行上［20，21］，而對在溫度與亞硝態氮含量均較高的條件下短程反硝化單菌種的研究鮮見報道。亞硝酸型反硝化是一個復雜生化過程，是短程硝化反硝化的重要過程。本研究采用梯度馴化得到高效的短程反硝化菌，優化影響短程反硝化的環境因子，構建亞硝酸鹽氮降解動力學模型及初步探討其酶活，以期為短程硝化反硝化工藝的應用以及傳統反硝化過程中亞氮積累問題的解決提供技術參數。同時短程反硝化微生物的特性、亞硝酸鹽還原酶的

表達及其應用有待于進一步研究。

4 結論

馴化得到高溫短程反硝化菌Brevibacillussp.XF-03，該菌株最佳生長碳源為琥珀酸鈉，碳氮比（C/N）為12。

動力學模型具有良好的有效性，相關系數（R2）為0.992。

亞硝酸鹽還原酶是短程反硝化菌降解亞硝態氮的關鍵酶，在菌株Brevibacillussp.XF-03生長指數期的后期，產生大量亞硝酸鹽還原酶，且亞硝酸鹽還原酶的比活力達到最大值0.279（U/mg protein）。

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（責任編輯 李楠）

Characteristics and Degradation Kinetics of Thermophilic Shotcut Denitrifier Brevibacillus sp.XF-03

Hao Minna Yang Yunlong Ge Qilong
（College of Environmental Science and Engineering，Taiyuan University of Technology，Taiyuan 030024）

The denitrifier Brevibacillus sp. XF-03 could reduce high nitrite concentration（1 000 mg/L）under the condition of high temperature（50℃）by the method of gradient domestication. The effects of carbon source and C/N on growth and denitrification of the denitrifier were optimized by single factor experiments. The results showed that the optimum shortcut denitrification carbon source of Brevibacillus sp. XF-03 was sodium succinate, optimum C/N ratio 12∶1. Under the optimal condition, the nitrite removal efficiency reached 95.1% within 42 hours when the original concentration of NO-2-N was 100 mg/L. Nitrite degradation kinetic studies indicated that the strain followed Haldane’s model, and the parameters were：μmax（maximum specific rate）=1.28 h-1, Ks（half-satruration constant）=451.42 mg/L, Ki（inhibition constant）= 176.77 mg/L. Nitrite reductase（NIR）activity was preliminary discussed. The NIR specific activity reached 0.279（U/mg protein）at the lag phase of exponential growth.

Brevibacillus sp.XF-03 High temperature Shortcut denitrification Nitrite degradation kinetics Enzyme activity

2013-07-29

郝敏娜，女，碩士研究生，研究方向：水污染控制；E-mail：tyuthaominna@163.com