三種霉菌產(chǎn)纖維素酶能力分析與培養(yǎng)條件優(yōu)化

三種霉菌產(chǎn)纖維素酶能力分析與培養(yǎng)條件優(yōu)化

胡翠英 李良智 趙建 錢(qián)瑋 顧華杰
（蘇州科技學(xué)院 化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，蘇州 215009）

對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有3種真菌產(chǎn)纖維素酶能力的分析及培養(yǎng)條件優(yōu)化。比較了3種菌在剛果紅培養(yǎng)基上的透明圈大小、并分析產(chǎn)纖維素酶酶活；通過(guò)單因素與響應(yīng)面分析的方法優(yōu)化毛酶產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件。通過(guò)試驗(yàn)得出3種真菌均能產(chǎn)纖維素酶，毛霉能產(chǎn)較多的纖維素酶。毛霉產(chǎn)纖維素酶的最佳條件為：pH 5.0，轉(zhuǎn)速 220 r/min，發(fā)酵時(shí)間47 h，發(fā)酵溫度 35 ℃，纖維素酶活為6.99 U/mL。毛霉、青霉、曲霉均產(chǎn)纖維素酶，毛霉能降解玉米芯纖維素。

霉菌 纖維素酶 培養(yǎng)條件 優(yōu)化

節(jié)約糧食和提高農(nóng)副產(chǎn)品的利用率，減少農(nóng)業(yè)廢棄物燃燒帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題，已經(jīng)引起眾多人的關(guān)注，將農(nóng)業(yè)廢棄物轉(zhuǎn)為可利用能源成為大家研究的課題。我國(guó)北方每年都有大量玉米芯被焚燒，如能加以利用，將節(jié)約原料成本，故降解此物成為本研究的目的。但一方面由于半纖維素與木質(zhì)素等組成的致密結(jié)構(gòu)，另一方面纖維素本身不能為丙酮丁醇梭菌直接利用，故需先進(jìn)行一連串的預(yù)處理、酶解等［1-3］，將纖維素降解為葡萄糖、木糖等單糖。纖維素酶的提取過(guò)程［4，5］較繁瑣，酶損失較大，成本較高，如能直接利用纖維素酶產(chǎn)生菌降解纖維素為單糖，可省去酶的提取、純化的過(guò)程，減少酶活力損失、節(jié)約成本。其降解物直接作為產(chǎn)能源菌的碳源，形成兩菌共培養(yǎng)的情形。目前纖維素降解菌研究［6-9］中多為真菌，且大多為青霉、曲霉、木霉等。本文的主要研究?jī)?nèi)容為從實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有霉菌中尋找纖維素降解菌，比較纖維素酶活，優(yōu)化培養(yǎng)條件，為進(jìn)行共培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 青霉、毛霉、曲霉，來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。玉米芯：來(lái)自山西農(nóng)村，往年擱置1年，風(fēng)干粉碎過(guò)40目篩子備用。

1.1.2 主要儀器 纖維素酶活測(cè)定采用723PC型分

光光度計(jì)（上海欣茂），發(fā)酵溶劑分析用氣相色譜儀GC112A型（上海精科），F(xiàn)ID檢測(cè)器，PEG毛細(xì)管柱。

1.1.3 試劑與培養(yǎng)基 檸檬酸、檸檬酸鈉、CMC-Na、纖維素酶、3，5-二硝基水楊酸。

菌種培養(yǎng)基：葡萄糖 30 g、NaNO32 g、K2HPO4·3H2O 1 g、 KCl 0.5 g 、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL，加熱至溶解，121 ℃高壓滅菌20 min。

纖維素剛果紅瓊脂培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、纖維素粉1.88 g、剛果紅0.2 g、瓊脂15 g、明膠2 g，蒸餾水1 000 mL，加熱至溶解，121 ℃高壓滅菌20 min。

玉米芯粉剛果紅瓊脂培養(yǎng)基：將纖維素剛果紅瓊脂培養(yǎng)基中的纖維素粉換成預(yù)處理玉米芯粉。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨 3 g、酵母膏0.2 g、（NH4）2SO42 g、KH2PO44 g、CaCl2·7H2O 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、CMC-Na 10 g、蒸餾水1 000 mL中，加熱至溶解，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 玉米芯預(yù)處理 稱(chēng)取15 g玉米芯粉，加入120 mL蒸餾水，滴加3%的硫酸，調(diào)pH 2-3，25℃處理48 h，70℃處理10 h，高溫110℃處理0.5 h，過(guò)濾，干燥備用。

1.2.2 纖維素酶產(chǎn)生菌鑒定 在菌種培養(yǎng)基上，37℃，200 r/min培養(yǎng)24 h。吸取稀釋好的菌液于剛果紅鑒定平板上，28℃恒溫培養(yǎng)2-3 d，轉(zhuǎn)到4℃冰箱，有利于釋放菌體中的纖維素酶，觀察透明圈。挑取單菌落做成斜面。

1.2.3 測(cè)定纖維素酶活 挑取透明圈較大的菌落，接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，200 r/min，37℃，培養(yǎng)24 h，離心，取得粗酶液，測(cè)定總酶活。測(cè)定方法CMCNa酶活，見(jiàn)文獻(xiàn)［9］。每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量，定義為一個(gè)酶活單位（U）。

酶活計(jì)算公式：酶活力（U/mL）=還原糖量/30*Ew

其中，30為水浴保溫時(shí)間，Ew為粗酶液的體積。

1.2.4 優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)條件 采用單因素試驗(yàn)，改變pH（分別為2、4、6、8、10）、搖床轉(zhuǎn)速（分別為100、150、200、250、300 r/min）、培養(yǎng)溫度（分別為20℃、30℃、40℃、50℃）、發(fā)酵時(shí)間（分別為24、48、72、96、120 h）等培養(yǎng)條件。根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 比較3種菌的纖維素降解能力

通過(guò)計(jì)算剛果紅培養(yǎng)基上透明水解圈與菌落直徑的比值、產(chǎn)酶培養(yǎng)基中菌種產(chǎn)酶活力分析3種菌的纖維素降解能力。表1為3種菌分別在碳源為纖維素粉或經(jīng)預(yù)處理的玉米芯粉培養(yǎng)基上透明圈與菌落直徑比。結(jié)果表明，青霉、毛霉、曲霉均可在纖維素粉培養(yǎng)基和玉米芯粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但在纖維素粉培養(yǎng)基上的菌落直徑較大，3種菌對(duì)玉米芯的利用能力較弱。毛霉的D/d值較其它兩種菌大，相對(duì)而言毛霉產(chǎn)纖維素酶活較大。圖1比較了不同真菌產(chǎn)酶的CMCase酶活力，進(jìn)一步說(shuō)明毛霉總酶活較高，達(dá)到3.28 U/mL，因此后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)以毛霉為研究對(duì)象。

表1 不同菌株在剛果紅培養(yǎng)基上透明圈直徑比

2.2 單因素試驗(yàn)

不同pH條件下酶活力中心可解離基團(tuán)的結(jié)構(gòu)不同，由圖2可知，酶活力隨pH的升高先升高后下降，且經(jīng)F檢驗(yàn)得出毛霉產(chǎn)纖維素酶的最適初始pH值為4-6之間，其酶活力約為3.7 U/mL。

轉(zhuǎn)速是影響好氧菌生長(zhǎng)的重要參數(shù)。從圖3可

看出，酶活隨著轉(zhuǎn)速的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且經(jīng)F檢驗(yàn)，搖床轉(zhuǎn)速在200 r/min左右，有較好的產(chǎn)纖維素酶能力，可達(dá)到2.1 U/mL。

圖1 不同菌種纖維素酶活

圖2 初始pH對(duì)纖維素酶活的影響

圖3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)纖維素酶活的影響

酶活隨培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短不同而不同。圖4體現(xiàn)為酶活力在培養(yǎng)48 h時(shí)最高，在培養(yǎng)時(shí)間低于48 h的范圍內(nèi)，酶活力隨時(shí)間的增大而變大，培養(yǎng)48 h時(shí)酶活最大為4.985 U/mL。培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)48 h后，酶活力隨時(shí)間的增大而逐漸變小，這應(yīng)該與底物濃度降低以及代謝產(chǎn)物抑制有關(guān)。

同樣，每種微生物都有一個(gè)最適宜纖維素酶保持酶活的溫度范圍。圖9中酶活力在培養(yǎng)溫度在40℃時(shí)最高，在低于40℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高而變大，但是在大于40℃的范圍內(nèi)，隨溫度的升高而逐漸變小。說(shuō)明溫度在40 ℃左右比較適合毛霉產(chǎn)生纖維素酶并保持酶活。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)纖維素酶活的影響

圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)纖維素酶活的影響

2.3 響應(yīng)面分析

為使發(fā)酵條件優(yōu)化，在對(duì)2.3試驗(yàn)結(jié)果分析的基礎(chǔ)上設(shè)置響應(yīng)面試驗(yàn)，選用pH（x1）、轉(zhuǎn)速（x2）、培養(yǎng)時(shí)間（x3）、培養(yǎng)溫度（x4）四種因素三水平設(shè)計(jì)。基本依據(jù)2.3結(jié)果中較佳條件向兩邊擴(kuò)充。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，變量分析見(jiàn)表3。

如果P＜0.05，則說(shuō)明模型中項(xiàng)的影響是顯著的，在這個(gè)模型中x3即培養(yǎng)時(shí)間是模型的顯著項(xiàng)。失擬項(xiàng)反應(yīng)的是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型不相符的情況，它的值為1.87，與整個(gè)模型的99.14比起來(lái)較小，表示不符合的數(shù)據(jù)相對(duì)于純誤差不顯著，即這個(gè)模型是比較符合實(shí)際數(shù)據(jù)。

根據(jù)Matlab與Design expert所做的分析，得二次擬合回歸方程：

酶活＝5.81-0.0908×x1-0.0608×x2-0.2433× x3+0.1533×x4-0.1125×x12+0.0100×x22-5.0512× x32+0.2613×x42-0.2350×x1×x2-0.0650×x1×x3-0.3075×x1×x4-0.0125×x2×x3+0.0150×x2×x4-0.0425×x3×x4

對(duì)模型進(jìn)行方差分析得R2=0.991 4，說(shuō)明方程有較好的擬合度，方程與實(shí)際情況比較相符，并能作出相對(duì)準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。

圖6中3個(gè)響應(yīng)面圖說(shuō)明4個(gè)因素對(duì)酶活影響趨勢(shì)與單因素試驗(yàn)結(jié)果相同，4個(gè)因素中發(fā)酵時(shí)間

是最大的影響因素。對(duì)方程求偏導(dǎo)為=0，得出最佳條件為：pH 5.0，轉(zhuǎn)速 222 r/min，發(fā)酵時(shí)間47.4 h，發(fā)酵溫度 35.4℃。

表2 三水平因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表3 三水平因子變量分析表

圖6 pH、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間、培養(yǎng)溫度對(duì)濾紙酶活的響應(yīng)面圖

為驗(yàn)證模型的符合度，做了驗(yàn)證試驗(yàn)，配制pH為5.0的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，準(zhǔn)備4個(gè)250 mL的搖瓶，倒入50 mL配制好的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，放置于溫度35 ℃，220 r/min，培養(yǎng)47 h，測(cè)定酶活。驗(yàn)證試驗(yàn)酶活力為6.99U/mL，方差不顯著，符合預(yù)期，所以模型可信，且所得值是本篇論文中最高值。

利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得蛋白質(zhì)含量為6.81 μg/ mL，得酶比活1.03×106。實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi)的纖維素酶比活為3.00×104，說(shuō)明在酶的提取純化過(guò)程中，損失酶活。所以，如能進(jìn)一步提高酶蛋白的產(chǎn)量，省略酶的提取純化過(guò)程，直接用于纖維素降解，降解產(chǎn)物直接被產(chǎn)能源的菌利用，可節(jié)約成本。

3 討論

纖維素是由D-葡萄糖以β-1，4糖苷鍵組成的大分子，Wood等［10-11］研究表明剛果紅與D-葡萄糖的β-1，4糖苷鍵、D-葡萄糖的β-1，3糖苷鍵等有較強(qiáng)的作用，顯示紅色。隨著纖維素的降解，紅色減弱形成透明圈，因此剛果紅染料可用于鑒定纖維素酶的存在［12-14］。通常透明圈大小與菌落直徑的比值同纖維素酶活間有一定關(guān)系，比值較大，則酶活相對(duì)較高［12，14，15］。試驗(yàn)室3種真菌青霉、毛霉、曲霉，均可產(chǎn)生纖維素酶，其中毛霉纖維素酶活相對(duì)較高。青霉屬、曲霉屬中也有產(chǎn)纖維素酶活較高的菌種，如許玉林等［17］得到的草酸青霉，習(xí)興梅等［18］得到的黑曲霉等。本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的青霉、曲霉相對(duì)較弱。

影響產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件中，毛霉產(chǎn)纖維素酶的最適培養(yǎng)基初始pH5.0，與相關(guān)文獻(xiàn)中真菌產(chǎn)纖維素酶的最適pH范圍相似［6，12］。可見(jiàn)毛霉為非嗜酸或嗜堿類(lèi)細(xì)菌，中性偏酸的培養(yǎng)條件較適合其纖維素酶的生產(chǎn)。搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，毛霉為好氧菌，搖床轉(zhuǎn)速對(duì)毛霉的生長(zhǎng)較重要，轉(zhuǎn)速太低，溶氧不足；轉(zhuǎn)速太高，對(duì)毛霉剪切力較大［16］。每種微生物都有一個(gè)最適宜生長(zhǎng)的溫度范圍［16］，本試驗(yàn)中溫度為35℃。

從試驗(yàn)結(jié)果分析，毛霉產(chǎn)酶活并不是很高，且完全降解纖維素僅靠1種微生物是難實(shí)現(xiàn)的，所以菌株的協(xié)同效應(yīng)在纖維素降解中尤為重要。在選擇菌種時(shí)應(yīng)充分考慮菌株之間的協(xié)同作用，防止拮抗作用的發(fā)生。試驗(yàn)初步探討了毛霉的產(chǎn)酶效果，對(duì)纖維素的高效降解具有一定的理論指導(dǎo)意義，至于菌株的產(chǎn)酶機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)纖維素總酶活的測(cè)定與比較，得出毛霉產(chǎn)酶活最高。通過(guò)對(duì)毛霉產(chǎn)酶條件的單因素試驗(yàn)與

響應(yīng)面分析優(yōu)化，得出較佳條件：pH 5.0，轉(zhuǎn)速 222 r/min，發(fā)酵時(shí)間47.4 h，發(fā)酵溫度 35.4度條件下產(chǎn)酶活最高為6.99 U/mL。

［1］ Qureshi N, Ezeji TC, Ebener J, et al. Butanol production by Clostridium beijerinckii. Part I：Use of acid and enzyme hydrolyzed corn fiber［J］. Bioresource Technology, 2008, 99（13）：5915-5922.

［2］ Qureshi N, Saha BC, Dien B, et al. Production of butanol（a biofuel）from agricultural residues：Part I Use of barley straw hydrolysate［J］. Biomass and Bioenergy, 2010, 34（4）：559-565.

［3］ 陳守文, 馬昕, 汪履綏, 趙學(xué)慧. 稻草酶法水解液的丙酮丁醇發(fā)酵［J］. 工業(yè)微生物, 1998, 28（4）：30-34.

［4］ 繆靜, 張術(shù)臻, 程顯好, 等. 纖維素酶提取工藝及酶學(xué)性質(zhì)的研究［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36（19）：7954 - 7955, 7960.

［5］ 東平, 龐延軍, 李兆蘭. 綠色木霉產(chǎn)纖維素酶的提取分離及其性質(zhì)［J］. 徐州師范學(xué)院學(xué)報(bào), 1996, 14（2）：62-66.

［6］ 韓陽(yáng). 黑曲霉對(duì)海帶纖維素降解條件的研究［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010（3）：358-360.

［7］ 孫軍德, 陳南. 秸稈纖維素降解細(xì)菌的篩選及其產(chǎn)酶條件的研究［J］. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 41（2）：210-213.

［8］ 王洪媛, 范丙全. 三株高效秸稈纖維素降解真菌的篩選及其降解效果［J］. 微生物學(xué)報(bào), 2010, 50（7）：870-875.

［9］ 張濤, 皮雄娥, 劉偉, 朱立穎, 王欣. 纖維素降解菌的篩選和鑒定［J］. 現(xiàn)代食品科技, 2010, 26（4）：418-420.

［10］ Wood PJ. Factors affecting precipitation and spectral changes associated with complex-formation between dyes and β-D-glucans［J］. Carbohydrate Research, 1982, 102（1）：283-293.

［11］ Teather RM, Wood PJ. Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1982, 43（4）：777-780.

［12］ 買(mǎi)爾哈巴·艾合買(mǎi)提, 樊振, 李越中, 等. 瘤胃中纖維素分解菌的分離、鑒定及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化［J］. 微生物學(xué)報(bào), 2013, 53（5）：470-477.

［13］ 張歡, 寇巍, 王曉明, 等. 產(chǎn)纖維素酶菌株的選育分析及發(fā)酵工藝優(yōu)化［J］. 環(huán)境化學(xué), 2013, 32（4）：605-611.

［14］ 馬雪姣, 李靜, 徐靜靜, 楊力. 奶牛糞便纖維素降解菌的篩選［J］. 西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2013, 38（3）：134-137.

［15］ 王大為, 王影, 遲燕平. 纖維素降解菌的分離篩選及酶活測(cè)定［J］. 食品工業(yè), 2013, 34（5）：219-221.

［16］ 曹軍衛(wèi), 馬輝文, 張甲耀. 微生物工程［M］. 第2版. 北京：科學(xué)出版社, 2007：92-113.

［17］ 許玉林, 鄭月霞, 葉冰瑩, 等. 一株纖維素降解真菌的篩選及鑒定［J］. 微生物學(xué)通報(bào), 2013, 40（2）：220-227.

［18］ 習(xí)興梅, 曾光明, 郁紅艷, 等. 黑曲霉Aspergillus niger木質(zhì)纖維素降解能力及產(chǎn)酶研究［J］. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 26（4）：1506-1511.

（責(zé)任編輯 李楠）

Analysis on Cellulase Producing Abilities of Three Kinds of Fungi and Optimization of Cultivation Conditions

Hu Cuiying Li Liangzhi Zhao Jian Qian Wei Gu Huajie
（College of Chemistry，Biology and Materials Engineering，Suzhou University of Science and Technology，Suzhou 215009）

We analyzed the cellulose degradation ability of three kinds of fungi （Penicillium, Mucor and Aspergillus） preserved in the laboratory and optimalized the culture conditions. The transparent ring size of three kinds of fungi training in the congo red medium and in the corncob congo red medium was observed. The cellulase activity was measured of the three fungi cultured in the CMC-Na medium. Single factor and response surface methodology were used to optimize the culture condition. The three kinds of fungi all could produce cellulase. The cellulase activity of Mucor was higher than the other two cultured in the the CMC-Na medium. The optimized conditions were below：pH was 5.0, the shaking speed was 220 r/min，fermentation time was 47 h，fermentation temperature was 35 ℃. The highest CMCase activity was 6.99 U/mL training on the optimized condition. Penicillium, Mucor and Aspergillus produced cellulase and Mucor could degrade corncob.

Fungi Cellulase Culture condition Optimize

2013-10-14

作者簡(jiǎn)介：胡翠英，女，碩士，研究方向：發(fā)酵工程研究；E-mail：13151170848@163.com