翹嘴紅鲌(♀)×黑尾近紅鲌(♂)雜種F1的AFLP分析

陳 見李 清王貴英李 佩劉英武

(1. 武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所, 武漢 430207; 2. 武漢先鋒水產(chǎn)科技有限公司, 武漢 430207)

翹嘴紅鲌(♀)×黑尾近紅鲌(♂)雜種F1的AFLP分析

陳 見1,2李 清1,2王貴英1,2李 佩1,2劉英武1,2

(1. 武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所, 武漢 430207; 2. 武漢先鋒水產(chǎn)科技有限公司, 武漢 430207)

采用AFLP 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)翹嘴紅 鲌(♀)、 黑尾近紅 鲌(♂)及雜種F1三個(gè)群體各12個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳差異分析。結(jié)果表明: 9對(duì)引物共擴(kuò)增出257條帶, 多態(tài)性比例為51.36%; 三個(gè)群體間特異條帶共24條, 其中黑尾近紅 鲌群體和雜種F1群體共有特異帶15 條、翹嘴紅 鲌群體和雜種F1群體共有特異帶2 條、翹嘴紅鲌群體特異帶7條; 黑尾近紅 鲌 群體、翹嘴紅 鲌群體及雜種F1群體的Shannon’s信息指數(shù)分別為0.2326、0.0794和0.1774, Nei’s基因多樣性指數(shù)分別為0.1602、0.0537和0.1229, 期望雜合度分別為0.1582、0.0464和0.1062;雜種F1群體和黑尾近紅 鲌 群體及翹嘴紅 鲌群體遺傳距離分別為0.0523、0.2165, 遺傳相似系數(shù)分別為0.9490、0.8053, 遺傳數(shù)據(jù)表明雜種F1更接近于父本黑尾近紅 鲌。

翹嘴紅鲌; 黑尾近紅 鲌; 雜種F1; AFLP; 遺傳差異

翹嘴紅 鲌Erythroculter ilishaeformis (Bleeker)隸屬鯉形目、鯉科、 鲌亞科、 鲌屬, 在我國(guó)江河與湖泊皆盛產(chǎn); 其自然個(gè)體大、肉質(zhì)細(xì)嫩、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高, 但人工養(yǎng)殖成本高、且性情急躁、不易捕撈、不耐活魚運(yùn)輸。黑尾近紅 鲌(Ancherythroculter nigrocauda Yih et Wu )隸 屬鯉形目、鯉科、 鲌亞科、近紅 鲌屬, 是長(zhǎng)江上游特有經(jīng)濟(jì)魚類; 其人工養(yǎng)殖成本低、性情溫馴、易捕撈、易活魚上市, 但體型市場(chǎng)接受率不及翹嘴紅 鲌。鑒于此, 本實(shí)驗(yàn)以丹江口水庫(kù)翹嘴紅 鲌為母本、黑尾近紅 鲌為父本進(jìn)行了兩種魚類的屬間遠(yuǎn)緣雜交, 獲得雜種 F1。通過對(duì)三種魚的形態(tài)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn), 雜種F1在形態(tài)上接近于母本翹嘴紅 鲌; 通過對(duì)比養(yǎng)殖發(fā)現(xiàn), 雜種 F1的生長(zhǎng)速度顯著高于父母本, 飼料轉(zhuǎn)化率顯著高于母本翹嘴紅 鲌。

AFLP技術(shù)由于多態(tài)性高、可重復(fù)性好、位點(diǎn)數(shù)多和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[1], 在(種內(nèi)、種間)雜交個(gè)體的鑒定方面發(fā)揮了巨大的作用[2], 有時(shí)甚至比微衛(wèi)星等共顯性標(biāo)記更具優(yōu)勢(shì)[3]。目前, AFLP在植物雜交分析中報(bào)道較多[4], 而在魚類家系篩選和遺傳育種工作中, 運(yùn)用AFLP進(jìn)行雜交分析也有少量報(bào)道。Liu等[5]利用AFLP技術(shù)分析了斑點(diǎn)叉尾和長(zhǎng)鰭叉尾及其雜交后代, 表明AFLP標(biāo)記符合孟德爾遺傳規(guī)律, 重現(xiàn)性好, 并認(rèn)為該技術(shù)可運(yùn)用在叉尾的遺傳分析、基因作圖及輔助育種上。Congiu等[6]利用AFLP技術(shù)成功鑒定出鱘魚的雜交后代。

本文采用AFLP 技術(shù)對(duì)翹嘴紅 鲌(♀)×黑尾近紅鲌(♂)雜種 F1進(jìn)行分析, 期望通過該技術(shù)能夠成功鑒定出雜種F1, 并對(duì)三種 鲌類進(jìn)行遺傳特性評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

翹嘴紅 鲌群體引自于丹江口水庫(kù), 黑尾近紅鲌群體引自于長(zhǎng)江上游, 以上兩群體經(jīng)武漢先鋒水產(chǎn)科技有限公司(先鋒公司)多代選育, 目前均在先鋒公司基地進(jìn)行人工養(yǎng)殖。雜種 F1系上述兩個(gè)群體雜交獲得[翹 嘴紅 鲌(♀)× 黑尾近紅 鲌(♂)]。在先鋒公司養(yǎng)殖基地取上述三個(gè)群體各 12尾, 分別剪尾鰭保存于無水乙醇中, 帶回實(shí)驗(yàn)室置于 4℃冷庫(kù)中備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

基因組DNA提取 采用Promega公司DNA提取試劑盒, 提取尾鰭中的DNA; 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性, 分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度。若A260/280=1.8—2.0, 說明DNA純度好, 則適合進(jìn)行AFLP分析。

AFLP分析 基因組 DNA的限制性酶切和接頭連接; 使用 MseⅠ和 EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶(NEB公司)各5 U, 在37℃水浴中, 同時(shí)對(duì)550 ng基因組DNA進(jìn)行雙酶切, 反應(yīng)3h后70℃下對(duì)限制性內(nèi)切酶滅活 15min。向酶切產(chǎn)物中分別加入 MseⅠ接頭(50 μmol/L)和EcoRⅠ接頭(5 μmol/L)各1 μL, T4 DNA連接酶(NEB公司) 0.2 μL, 13.8 μL單蒸水, 4.0 μL buffer, 16℃反應(yīng)過夜, 接頭具體序列見表1。

表1 AFLP接頭及引物序列Tab. 1 Sequences of adaptors and primers in AFLP analysis

預(yù)擴(kuò)增反應(yīng): 取上述連接產(chǎn)物1.5 μL作為預(yù)擴(kuò)增的模板, 分別加入預(yù)擴(kuò)增引物EcoRⅠ和預(yù)擴(kuò)增引物MseⅠ各4.0 μL進(jìn)行擴(kuò)增, 預(yù)擴(kuò)增引物具體序列見表1。PCR反應(yīng)體系4.0 μL buffer, 2.4 μL 25 mmol/L MgCl2, 0.5 U Taq酶, 0.4 μL 10 mmol/L dNTP, 4 μL 10 μmol/L primer, 1.5 μL連接產(chǎn)物, 加水至40 μL。反應(yīng)條件: 94℃ 30s, 56℃ 60s, 72℃ 60s, 循環(huán)數(shù)為25; 取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物, 1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

選擇性擴(kuò)增: 將上述預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍, 作為選擇性擴(kuò)增的模板。使用9對(duì)MseⅠ和EcoRⅠ選擇性擴(kuò)增引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增, 預(yù)擴(kuò)增引物具體序列見表1; 引物對(duì)分別為: E1-M3、E5-M13、E5-M14、E8-M10、E9-M1、E10-M3、E12-M7、E12-M8、E16-M4。PCR反應(yīng)體系: 2.0 μL 10×buffer, 1.2 μL 25 mmol/L MgCl2, 1.0 U Taq, 0.4 μL 10 mmol/L dNTP, 2.0 μL 5 μmol/L primer, 5 μL預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物, 加水至20 μL。反應(yīng)條件: 94℃ 30s, 65℃(每循環(huán)降0.7℃) 30s, 72℃60s, 循環(huán)次數(shù)14; 94℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 60s, 循環(huán)數(shù)為24。

聚丙烯酰胺凝膠電泳分離: 對(duì)選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物采用 6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳, 并進(jìn)行銀染顯色,將凝膠自然風(fēng)干后通過肉眼進(jìn)行條帶分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)凝膠電泳結(jié)果, 選取清晰的多態(tài)條帶用于統(tǒng)計(jì)分析, 有帶的記為1, 無帶的記為0, 建立01數(shù)據(jù)矩陣。用Popgene 1.32[7]軟件計(jì)算Shannon’s信息指數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)、期望雜合度、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)百分比、遺傳距離和遺傳相似系數(shù)。多態(tài)位點(diǎn)比例是以位點(diǎn)的百分?jǐn)?shù)而不是以一個(gè)等位基因計(jì)算的。

用 Arlequin3.11[8]軟件對(duì)群體結(jié)構(gòu)在群體間和群體內(nèi)作分子方差分析(AMOVA)。群體間的遺傳距離根據(jù)Nei[9]非偏距離和相似測(cè)量, 用MEGA5.0[10]軟件構(gòu)建群體的UPGMA聚類圖。

2 結(jié)果

2.1 AFLP擴(kuò)增圖譜及其多態(tài)性和特異性

9對(duì)引物組合對(duì)36個(gè)樣本擴(kuò)增共得到257條清晰可辨、可重復(fù)的條帶, 其中多態(tài)位點(diǎn)132個(gè), 多態(tài)位點(diǎn)比率為51.36%; 平均每對(duì)引物組合擴(kuò)增出28.6條帶, 每對(duì)引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)范圍為(22—43)條。三個(gè)群體間特異條帶共24條, 其中黑尾近紅 鲌群體和雜種F1群體共有特異帶15 條、翹嘴紅 鲌群體和雜種F1群體共有特異帶2 條、翹嘴紅 鲌群體特異帶7條(圖1)。

2.2 遺傳多樣性及其方差分析

從表2 可以看出黑尾近紅 鲌群體的 Shannon’s信息指數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)、期望雜合度、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)百分比最高, 雜種F1群體其次,翹嘴紅 鲌群體最低, 表明黑尾近紅 鲌群體的遺傳多樣性最高。

從表 3可以看出, 三個(gè)群體在遺傳差異的總方差中, 54.51%的差異來自種群間, 45.49%的差異來自種群內(nèi); 表明種群間的差異比較大。

2.3 遺傳距離及其遺傳相似系數(shù)

由表4可見, 雜種F1和黑尾近紅 鲌的遺傳距離0.0523, 小于翹嘴紅 鲌0.2165; 而雜種 F1和黑尾近紅 鲌的遺傳相似系數(shù)0.9490, 大于翹嘴紅 鲌0.8053。

如圖2所示, 據(jù)表4的遺傳距離數(shù)據(jù), 以UPGMA方法構(gòu)建了三個(gè)種群的聚類分析圖, 雜種F1群體首先和黑尾近紅 鲌群體聚為一類, 然后和翹嘴紅 鲌群體聚為一類。

圖1 引物對(duì)E9-M1擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 AFLP profile amplified by selective primer set E9-M1

表2 黑尾近紅鲌、翹嘴紅鲌及雜種F1三個(gè)群體遺傳多樣性Tab. 2 Genetic diversity of A. nigrocauda, E. ilishaeformis and their hybrid F1

3 討論

表 3 黑尾近紅鲌、翹嘴紅鲌及雜種 F1三個(gè)群體遺傳多樣性方差分析Tab. 3 AMOVA results of A. nigrocauda, E. ilishaeformis and their hybrid F1

表4 三個(gè)群體遺傳距離(左下)及遺傳相似系數(shù)(右上)Tab. 4 Genetic distance (below diagonal) and similarity (above diagonal) of the three populations in this study

圖2 據(jù)Nei遺傳距離用UPGMA方法構(gòu)建的三個(gè)種群的聚類分析圖Fig. 2 UPMGA dendrogram of three populations in this study are based on Nei’s genetic distance

AFLP是一種 DNA指紋分析技術(shù), 能夠靈敏檢測(cè)DNA的多態(tài)性, AFLP分析中的多態(tài)比例和遺傳差異度是衡量群體遺傳分化和親緣關(guān)系的重要指標(biāo)[11,12]。本研究采用AFLP 技術(shù)分析黑尾近紅 鲌、翹嘴紅 鲌及雜種F1三個(gè)群體的遺傳多樣性, 結(jié)果表明黑尾近紅 鲌群體的Shannon’s信息指數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)、期望雜合度、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)百分比最高, 雜種F1群體次之, 翹嘴紅 鲌群體最低;雜種F1群體的遺傳多樣性處于黑尾近紅 鲌群體和翹嘴紅 鲌群體之間。于濤等[13]通過AFLP技術(shù)分析櫛孔扇貝、蝦夷扇貝及其雜交子代的遺傳多樣性, 表明雜交子代群體的遺傳多樣性水平比2個(gè)親本群體都高; 董穎等[14]對(duì)中華絨毛蟹和日本絨毛蟹及其雜交子代的 AFLP分析研究表明, 雜交子代的遺傳多性介于兩個(gè)親本之間, 雜交未使群體遺傳多樣性升高, 這與本研究結(jié)果相同。池喜峰等[15]用微衛(wèi)星技術(shù)對(duì)荷包紅鯉和德國(guó)鏡鯉的正反雜交組遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)正交組子代遺傳多樣性低于父母本;分析認(rèn)為可能是所選取的親本經(jīng)過連續(xù)多代的人工養(yǎng)殖, 在相同的養(yǎng)殖環(huán)境中群體親緣關(guān)系較近, 而近親繁殖導(dǎo)致這一現(xiàn)象的發(fā)生。在本研究中雜種F1遺傳多樣性介于2個(gè)親本之間, 而父本黑尾近紅鲌最高, 分析認(rèn)為可能是: 母本翹嘴紅 鲌來源于同一個(gè)水域并經(jīng)連續(xù)多代人工選育, 黑尾近紅 鲌雖經(jīng)連續(xù)多代人工選育, 但來自于三個(gè)不同水域, 仍保持較高的遺傳多樣性。同時(shí), AFLP標(biāo)記屬于顯性標(biāo)記,無法區(qū)分雜合基因型和顯性純合基因型, 利用顯性標(biāo)記估算的遺傳值, 是在假定群體為遺傳平衡群體下得出的, 而這種假定往往具有不可靠性[16]; 隨機(jī)9對(duì)引物的篩選以及樣本數(shù)量, 也往往對(duì)估算的遺傳值造成一定的影響, 故本研究的結(jié)論需要更進(jìn)一步的驗(yàn)證和探討。

三個(gè)群體在遺傳差異的總方差中, 54.51%的差異來自種群間, 45.49%的差異來自種群內(nèi); 表明三個(gè)群體之間有較大的遺傳差異, 說明雜種F1同父母本之間差異較大, 在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中也表明雜種F1有著優(yōu)于父母本的養(yǎng)殖性狀。王偉偉等[17]利用AFLP技術(shù)研究 6個(gè)地理群體斑鱖的遺傳多樣性, 分子方差分析表明變異主要發(fā)生在群體間, 各地理群體斑鱖有極顯著的遺傳分化。

本次研究中雜種F1群體從遺傳距離及遺傳相似系數(shù)來看, 與父本黑尾近紅 鲌群體更接近, 但是雜種F1群體的形態(tài)上卻更接近于翹嘴紅 鲌群體; 生長(zhǎng)速度明顯優(yōu)于父母本群體, 飼料轉(zhuǎn)化率明顯優(yōu)于母本翹嘴紅 鲌群體、與父本黑尾近紅 鲌群體基本一致。雜交后代遺傳特性偏向于一方親本是很常見的一種現(xiàn)象, 這可能是由于雜交不親和、染色體丟失、雌核發(fā)育二倍體、雄核發(fā)育二倍體等原因造成。劉蘇等[18]通過AFLP技術(shù)分析斑鱧、烏鱧及其雜種群體遺傳特性, 顧志敏等[19]通過RAPD技術(shù)分析翹嘴紅鲌(♀)與團(tuán)頭魴(♂)的雜種 F1群體遺傳特性, 發(fā)現(xiàn)雜種偏向于父本。徐冬冬[20]對(duì)褐牙鲆和夏牙鲆及其正反交子代 AFLP分析表明, 雜交子代和母本的關(guān)系較近。王曉清等[21]對(duì)大黃魚和魚雜交分析, 表明雜交子代與母本大黃魚之間具有極高的遺傳同質(zhì)性,屬異精雌核發(fā)育個(gè)體。

魚類遠(yuǎn)緣雜交育種, 是改善魚類性狀的一種行之有效方法。本文研究的翹嘴紅 鲌(♀)× 黑尾近紅鲌(♂)雜種F1, 在形態(tài)上接近翹嘴紅 鲌, 體型市場(chǎng)更易接受; 在生長(zhǎng)速度、飼料轉(zhuǎn)化率等經(jīng)濟(jì)性狀上也體現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì); 本研究嘗試從分子方面闡述了雜種F1的雜種優(yōu)勢(shì), 從理論與實(shí)踐綜合分析說明雜種F1是一個(gè)優(yōu)良的養(yǎng)殖新品種。

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ANALYSIS OF THE HYBRID F1BETWEEN ERYTHROCULTER ILISHAEFORMIS♀×ANCHERYTHERYTHROCULTER NIGROCAUDA♂ BY AFLP MARKER TECHNIQUE

CHEN Jian1,2, LI Qing1,2, WANG Gui-Ying1,2, LI Pei1,2and LIU Ying-Wu1,2
(1. Wuhan Aquaculture Science Research Institute, Wuhan 430207, China; 2. Wuhan Xianfeng Aquaculture Technology Co. Ltd, Wuhan 430207, China)

AFLP molecular marker technique was utilized to analyze the genetic differences among Erythroculterilishaeformis, Ancherythroculter nigrocauda and their hybrid F1(E. ilishaeformis♀×A. nigrocauda; 12 individuals each). A total of 257 bands were obtained by 9 primer combinations, and the percentage of polymorphic loci was 51.36%. There were 24 specific bands in the three populations. There were 15 shared specific bands between the A. nigrocauda and hybrid F1,and 2 were between the E. ilishaeformis and hybrid F1. There were 7 specific bands of E. ilishaeformis. The Shannon’s information indexes of A. nigrocauda, E. ilishaeformis and hybrid F1were 0.2326, 0.0794 and 0.1774, respectively. The Nei’s gene diversity indexes of the three populations were 0.1602, 0.0537 and 0.1229, respectively. The expected heterozygosity among the three populations was 0.1582, 0.0464 and 0.1062, respectively. The genetic distance was 0.0523 between the A. nigrocauda and hybrid F1and was 0.2165 between the E. ilishaeformis and hybrid F1. The genetic similarity coefficients between the A. nigrocauda and hybrid F1was 0.9490, and it was 0.8053 between the E. ilishaeformis and hybrid F1. These data showed that the hybrid F1was more homogeneous to the male parent of A. nigrocauda.

Erythroculter ilishaeformis; Ancherythroculter nigrocauda; The hybrid F1; AFLP; Genetic differences

Q346+.5

A

1000-3207(2014)05-0891-06

10.7541/2014.133

2013-07-22;

2014-02-23

國(guó)家科技支撐計(jì)劃子課題(2012BAD25B06—07); 農(nóng)業(yè)部“湖 北武漢 鲌魚良種場(chǎng)”項(xiàng)目(文號(hào): 農(nóng)計(jì)函[2007]403號(hào))資助

陳見(1983—), 男, 湖北洪湖人; 碩士; 研究方向?yàn)轸~類遺傳育種。E-mail: chenjian.316@163.com

李清, E-mail: xfsckj@163.com