發(fā)狀念珠藻胞外多糖體外免疫活性研究①

郭金英 杜 潔 李彤輝 任國艷 王 萍 張玉先 馮惠敏

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽 471023)

發(fā)狀念珠藻(Nostoc flagelliforme)是一種生活在干旱、半干旱地區(qū)的藍(lán)藻［1］，在我國發(fā)現(xiàn)已有近兩千年的歷史。它富含蛋白質(zhì)、多糖、20 多種微量元素和19 種氨基酸，是一種重要的食品和藥品資源［2］。

發(fā)狀念珠藻多糖是一種酸性雜多糖，由木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖以及葡萄糖醛酸組成，是發(fā)狀念珠藻藻體正常的分泌物質(zhì)，是一種極具開發(fā)潛力的天然藥物資源［3］。日本微細(xì)藻類綜合研究所和富山醫(yī)科藥科大學(xué)率先從發(fā)狀念珠藻藻體中分離出多糖，并對其結(jié)構(gòu)和生理活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)狀念珠藻在生長過程中向細(xì)胞外分泌的多糖具有抗病毒［4］、抗氧化和清除自由基［5］等功效。

近年來發(fā)狀念珠藻多糖的研究多集中在多糖的分離純化、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)等方面。Yu 等［6］研究獲得了發(fā)狀念珠藻胞外多糖和莢膜多糖的理想提取工藝，并得到了單一多糖，并論證了胞外多糖和莢膜多糖對幾種活性自由基均有清除能力。賈夢瑤等［7］對液體懸浮培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻產(chǎn)生的粗多糖進(jìn)行了質(zhì)量分析。Dai 等［8］采用徑向流色譜法研究了發(fā)狀念珠藻多糖的純化。

藻類多糖是一種免疫調(diào)節(jié)劑，對免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用，它能激活淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、細(xì)胞毒性T 細(xì)胞等免疫細(xì)胞，還能促進(jìn)細(xì)胞因子生成，從而在抗腫瘤方面顯示出獨(dú)特功效。發(fā)狀念珠藻多糖作為一種非常有應(yīng)用前景的生物多糖，其生物活性的研究尚處于起步階段，未見多糖體外活性研究的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)選用液體懸浮培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻為材料，在前期分離純化發(fā)狀念珠藻胞外多糖的基礎(chǔ)上，進(jìn)行發(fā)狀念珠藻胞外多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化活性的研究，為發(fā)狀念珠藻的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)液(RPMI1640)、胎牛血清和二甲基亞砜(北京康為世紀(jì)有限公司);刀豆蛋白A(ConA)和噻唑藍(lán)(MTT)(Sigma 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 ICR 小鼠，雄性，體重18～22 g(河南科技大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心)。

1.3 儀器 R205 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司);LG-5 真空冷凍干燥機(jī)(上海市離心機(jī)械研究所);722S 可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);TGL-16G 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);SW-CJ-1F 超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);E191IR CO2培養(yǎng)箱(GOLD-SIM 公司);Stat Fax 2100 酶標(biāo)儀(北京卓信偉業(yè)科技有限公司)。

1.4 發(fā)狀念珠藻液體培養(yǎng) 活化后的發(fā)狀念珠藻無菌條件下懸浮于新鮮的100 ml BG-11 培養(yǎng)液中，調(diào)整懸浮液濃度，至A750 nm 約為1。于生化培養(yǎng)箱中在25℃和4 000 Lx 光照強(qiáng)度下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，每20 d 為一個(gè)周期。

1.5 發(fā)狀念珠藻胞外多糖制備 熱水提取-木瓜蛋白酶水解蛋白質(zhì)-乙醇沉淀-蒸餾水溶解-sevag 試劑脫蛋白-乙醇沉淀-蒸餾水溶解-冷凍干燥。通過硫酸-苯酚法測得胞外多糖純度為82.50%。

1.6 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液制備 將ICR 小鼠脫頸椎處死，無菌摘取脾臟，過200 目網(wǎng)篩，用PBS 液洗滌2～3 次，1 500 r/min 離心10 min;加入紅細(xì)胞裂解液，冰上孵育15 min，450 r/min 離心10 min 收集白細(xì)胞，吸棄上清液;再用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整到5×106個(gè)/ml，冷藏備用［9］。

1.7 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將多糖質(zhì)量濃度設(shè)定在100 μg/ml，設(shè)置7 個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、12、24、36、48、60 和72 h)，測定不同培養(yǎng)時(shí)間下多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化作用的影響。

設(shè)置5 個(gè)多糖濃度梯度(0、25、50、100 和200 μg/ml)，培養(yǎng)脾淋巴細(xì)胞60 h，測定不同濃度多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化作用的影響。

1.8 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入100 μl 脾淋巴細(xì)胞懸液及100 μl糖液;空白對照組加100 μl 脾淋巴細(xì)胞懸液和100 μl 細(xì)胞培養(yǎng)液。每組設(shè)5 復(fù)孔，在37℃、CO2濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)對應(yīng)的一段時(shí)間后，每孔加入20 μl 5 μg/ml 的MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。每孔吸棄上清液，加入二甲基亞砜150 μl，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解［10］。酶標(biāo)儀測其在492 nm 處吸光度。

1.9 小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 取96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)組每孔加100 μl 脾淋巴細(xì)胞懸液、100 μl糖液和20 μl 10 μg/ml ConA 溶液;ConA 對照組加100 μl 脾淋巴細(xì)胞懸液、100 μl 細(xì)胞培養(yǎng)液和20 μl 10 μg/ml ConA 溶液。其他操作方法同1.8。

2 結(jié)果

2.1 多糖在不同培養(yǎng)時(shí)間對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響 由圖1 可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性明顯提高，各實(shí)驗(yàn)組之間差異顯著;與空白對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性顯著提高;隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組和空白對照組的脾淋巴細(xì)胞一直在增殖，A492nm呈上升趨勢，且在36、48、60 及72 h 時(shí)，淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)更加明顯，72 h 時(shí)A492nm 達(dá)最大值;隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，多糖促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖能力呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性。

圖1 多糖在不同培養(yǎng)時(shí)間對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響Fig.1 Temporal-dependent effect of polysaccharose on proliferation of mouse spleen cells

2.2 多糖在不同培養(yǎng)時(shí)間對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性的影響

ConA 具有強(qiáng)力的促有絲分裂作用，單獨(dú)作用于淋巴細(xì)胞時(shí)能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化，而當(dāng)ConA與某些抗原共同作用時(shí)，對淋巴細(xì)胞有絲分裂的促進(jìn)作用便形成了特殊的協(xié)同作用。圖2 顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性明顯提高，各實(shí)驗(yàn)組之間差異顯著;各實(shí)驗(yàn)組和ConA 對照組的A492 nm 隨培養(yǎng)時(shí)間的延長一直呈上升趨勢，且在36、48、60 及72 h 時(shí)，脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性明顯提高，72 h 時(shí)A492 nm 達(dá)最大值;與各實(shí)驗(yàn)組的ConA 對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化活性明顯提高，說明多糖與ConA 有協(xié)同作用，增強(qiáng)了淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力。

2.3 不同濃度多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響 不同濃度多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響見圖3，可以看出，同糖液濃度為零的對照組相比，糖液濃度為25 μg/ml 實(shí)驗(yàn)組的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性沒有顯著提高，而糖液濃度為50、100 和200 μg/ml 實(shí)驗(yàn)組的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性極顯著提高，說明多糖可刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，并表現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)。隨著多糖質(zhì)量濃度的提高，A492nm 先升后降，且在質(zhì)量濃度100 μg/ml 時(shí)取得最大值，其增殖效果最為明顯，而200μg/ml濃度時(shí)，A492nm 下降，說明多糖高于一定濃度后，反而對細(xì)胞分裂起一定抑制作用。

圖2 多糖在不同培養(yǎng)時(shí)間對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性的影響Fig.2 Temporal-dependent effects of polysaccharose on transformation of mouse spleen cells

圖3 不同濃度多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響Fig.3 Dose-dependent effect of polysaccharose on proliferation of mouse spleen cells

圖4 不同濃度多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性的影響Fig.4 Dose-dependent effect of polysaccharose on transformation of mouse spleen cells

2.4 不同濃度多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性的影響 從圖4 可知，在一定劑量范圍內(nèi)多糖與ConA共同作用，能夠顯著提高脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力。同糖液濃度為零的對照組相比，糖液濃度為25 μg/ml實(shí)驗(yàn)組的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性顯著提高，糖液濃度為50、100 和200 μg/ml 實(shí)驗(yàn)組的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性極顯著提高。隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，A492nm 呈先上升后下降趨勢，且在質(zhì)量濃度100 μg/ml 時(shí)，其轉(zhuǎn)化作用最強(qiáng)，大于100 μg/ml 濃度時(shí)，其轉(zhuǎn)化作用隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而減弱。

3 討論

脾臟是機(jī)體內(nèi)重要的免疫器官，是體外試驗(yàn)中淋巴細(xì)胞的重要來源。脾淋巴細(xì)胞包括T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞，并且ConA 及LPS 可以誘導(dǎo)它們活化。脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化活性的檢測在評價(jià)細(xì)胞免疫功能中具有重要意義，其增殖轉(zhuǎn)化效果決定了效應(yīng)淋巴細(xì)胞的數(shù)量，反映出機(jī)體免疫水平的高低，因此可作為測定體外免疫活性影響的指標(biāo)。

宋利華等［11］發(fā)現(xiàn)通過采用柱分離對人參酸性多糖進(jìn)行逐級分離，各級分對脾淋巴細(xì)胞增殖都有不同程度的促進(jìn)作用，其中GPA-4 刺激作用最強(qiáng)。本研究表明發(fā)狀念珠藻胞外多糖有促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力，并隨著時(shí)間的延長而增強(qiáng)，這可能是由于多糖與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)了淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子［12］。脾淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)過不同物質(zhì)刺激后，可以在CO2培養(yǎng)箱72 h 內(nèi)檢測到其分裂活性，但由于刺激物質(zhì)不一樣，一般最佳培養(yǎng)時(shí)間也不一樣。

周妍［13］研究了不同的海洋微藻對脾淋巴細(xì)胞的增殖作用，發(fā)現(xiàn)不同種類多糖對淋巴細(xì)胞增殖作用不同。周昌艷等［14］研究結(jié)果表明熱水提取的灰樹花子實(shí)體多糖與菌絲體多糖對體外培養(yǎng)的小鼠淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化增殖作用輕微;堿溶性灰樹花多糖對體外培養(yǎng)的小鼠淋巴細(xì)胞的促進(jìn)增殖作用具有一定的量效關(guān)系。本研究則說明一定濃度范圍內(nèi)的發(fā)狀念珠藻胞外多糖對脾淋巴細(xì)胞增殖作用隨濃度上升而增大。不同物質(zhì)刺激同種類型的細(xì)胞，會產(chǎn)生不同的應(yīng)答效果，這種免疫應(yīng)答同分子的激活作用，可能與其對信號通路的開閉的影響有直接關(guān)系。

ConA 為促細(xì)胞有絲分裂素，主要對T 淋巴細(xì)胞有激發(fā)作用。用ConA 刺激在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞的體積會變大，代謝能力增強(qiáng)，并且蛋白質(zhì)和核酸的合成也有所增加。李江［15］研究了南極適冷菌胞外多糖對體外細(xì)胞免疫性的影響，結(jié)果表明南極適冷菌胞外多糖協(xié)同ConA 對脾淋巴細(xì)胞增殖的效果明顯高于單獨(dú)施用胞外多糖，且活性表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系。Chen 等［16］報(bào)道馬齒莧多糖對于ConA 誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞和LPS 誘導(dǎo)B 淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化均具有促進(jìn)作用。石磊等［17］觀察巖藻多糖對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)巖藻多糖高、中劑量組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值差明顯高于低劑量組，ConA 與多糖協(xié)同提高小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力。而本研究發(fā)現(xiàn)在ConA 協(xié)同作用下，發(fā)狀念珠藻胞外多糖顯著提高小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，并呈一定的劑量依賴性。

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