MSCs 上清可減輕雷公藤甲素對KGN 細胞的損傷作用①

周 雪 趙光鋒 陳士雯 侯亞義 (南京大學醫學院免疫與生殖生物學實驗室，南京 210093)

雷公藤在治療免疫性疾病和炎性疾病的過程中可對生殖系統產生副作用，引起女性的月經周期紊亂以及閉經［1］，甚至可能對卵巢造成不可逆性損害［2，3］，激素療法雖能回復部分女性卵巢功能，但對某些病例不起作用［2］，且激素療法會增加血栓、卵巢癌和乳腺癌的風險［4，5］。有研究提示，雷公藤可造成卵泡顆粒細胞層變薄，影響卵泡發育［6-8］。雷公藤甲素是雷公藤的主要活性成分［9］，對女性卵巢顆粒細胞的損害及作用機制尚不詳，且無改善這種損害的策略。間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有免疫抑制和免疫調節功能［10］，目前已逐漸用于自身免疫性疾病、炎性疾病及組織修復治療的研究［11］。有研究報道，MSCs 能夠分泌多種生長因子和細胞因子，改善卵巢蛋白及環磷酰胺等誘導的卵巢損傷［12-14］。但目前對于MSCs 的培養上清是否能改善雷公藤引起的卵巢顆粒細胞損傷尚未有研究。因此，本研究探討了MSCs 上清對雷公藤甲素損害人的卵巢顆粒細胞系KGN 的作用及其機制，試圖提出改善雷公藤甲素損害卵巢的策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 正常足月健康新生兒的新鮮臍帶取自于南京大學醫學院附屬鼓樓醫院婦產科，均經產婦及家屬授權同意，嚴格遵守醫學倫理道德，并得到相關倫理部門批準。人卵巢顆粒細胞系KGN 由南京大學醫學院附屬鼓樓醫院婦產科惠贈。DMEM/F12 培養基、FBS 胎牛血清購于Gibco 公司;流式抗體小鼠抗人CD29-PE、CD44-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD31-PE、CD34-PE、CD45-FITC 以 及HLA-DR-PE 購于eBioscience 公司;CCK-8 試劑購于日本同仁化學所，PI 購于Sigma 公司。

1.2 細胞培養

1.2.1 臍帶間充質干細胞(MSCs)的分離培養及表型鑒定 無菌條件下取出臍帶，立即放入滅菌預冷PBS 保存。取回后4 h 內按照本實驗室方法進行處理。首先，用含1%青鏈霉素混合液的PBS 洗去臍帶表面血塊，用眼科鑷子將臍動脈和靜脈剝除，放入含DMEM/F12 的培養皿中，剪碎至8～10 mm3小塊。然后，離心去除培養基，加入預先配置好的含250 U/ml 膠原酶Ⅱ，100 U/ml 中性蛋白酶及10 U/ml 透明質酸酶混合液，放入37℃搖床，振蕩消化2～3 h 至組織基本消化完全。經PBS 洗3 遍、DMEM/F12 洗2 遍，去除混合酶液。將細胞及組織碎片倒入培養瓶，加入含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素混合液及DMEM/F12 的完全培養基，放入37℃二氧化碳培養箱培養(5%CO2)，避免移動。3 d 后，除去未貼壁細胞及組織碎片，更換完全培養液，以后每3 d 更換一次，待成纖維樣細胞集落密度達80%左右，用0.25%EDTA 胰酶消化傳代，取第4～8 代細胞進行免疫表型鑒定。消化收集后，用PBS 洗兩遍，調整細胞密度為大約1×106ml-1，每管加入100 μl 細胞懸液，再按照建議濃度分別加入各自的流式抗體進行標記。避光孵育30 min，PBS 洗兩遍去除未標記抗體;加入2%多聚甲醛，4℃避光固定30 min;應用BD 公司FACSCalibur 流式細胞儀檢測免疫表型:CD29、CD44、CD90、CD105、CD31、CD34、CD45 以及HLA-DR，確認為MSCs 后用于實驗。

1.2.2 KGN 細胞培養 與MSCs 用相同的完全培養基在37℃二氧化碳培養箱進行常規培養，保持5%的CO2以維持pH 恒定。

1.3 CCK-8 法檢測細胞活力

1.3.1 細胞毒性檢測 CCK-8 試劑盒是基于WST-8 還原性的檢測試劑，WST-8 被細胞內脫氫酶生物還原后生成橙色甲臜染料，培養基顏色與活細胞數量成正比。KGN 細胞以3×103個/孔，接種至96 孔板，置于37℃培養箱過夜預培養，第二天分別加入2.5、5、10、20、40 及80 nmol/L 的雷公藤甲素處理24 h 和48 h，按照CCK-8 說明書加入試劑，孵育1～4 h，測定450 nm 處的吸光值。

1.3.2 細胞活力檢測 KGN 分組:(1)Control 組;(2)MSCs 上清組;(3)雷公藤甲素組;(4)MSCs 上清+雷公藤甲素組。用胰酶常規消化KGN 細胞，同樣將KGN 細胞以3×103個/孔，接種至96 孔板過夜預培養。向(3)(4)組加入40 nmol/L 雷公藤甲素處理24 h，(1)(2)用等量DMSO 作為對照;再向(2)(4)組加入MSCs 上清，(1)(3)加入完全培養基，24 h 后檢測細胞活力。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期 碘化丙啶PI(Propidium Iodide)是一種核酸熒光染料，能夠與DNA 和RNA 分子的堿基對進行插入性結合。將處理后的KGN 加入無EDTA 胰酶消化，用PBS 洗兩遍，再加入預冷的70%乙醇固定，置于4℃過夜;離心去除乙醇，再加入PBS 洗兩遍，加入含0.1% Triton X-100及2%RNase 的PI 工作液(PI 終濃度為50 μg/ml)懸起細胞，室溫避光孵育30 min，上機檢測，用ModFit LT 軟件分析周期。

1.5 Real-Time PCR 法檢測mRNA 表達 利用Trizol 法提取KGN 的總RNA，經氯仿抽提、分相及異丙醇沉淀后，用預冷的DEPC-75% 乙醇洗滌RNA，加入DEPC 水，在56℃條件下金屬浴熔解10 min，用紫外分光光度計測定濃度。定量0.5 μg 進行反轉錄。反應在TaKaRa 公司的PCR 儀中進行，20 μl 的反轉錄體系為:5× RT buffer 4 μl、dNTP 2 μl、RNase inhibitor 1 μl、Oligo d(T)1 μl、ReverTra Ace 0.5 μl、RNA 0.5 μg，再加入DEPC 水補足20 μl;反應在42℃20 min、99℃5 min 及4℃5 min，得到cDNA。隨后利用ABI 公司的StepOnePlus 熒光定量PCR 儀檢測mRNA 表達。引物序列為:βactin:Fp 5'-TCTGGCACCACACCTTCTA-3'，Rp 5'-AGGCATACAGGGACAGCAC-3';CDKN1A:Fp 5'-CTCATCCCGTGTTCTCCTTT-3'，Rp 5'-GTACCACCCAGCGGACAAGT-3'。10 μl 反應體系為:SYBR Green Supermix 5 μl、Forward primer 0.5 μl、Reverse primer 0.5 μl、cDNA 2 μl(預先稀釋10 倍)以及ddH2O 2 μl，反應條件:95℃10 min;95℃15 s、60℃30 s、72℃30 s 共40 循環;95℃15 s、60℃30 s、95℃15 s 繪制溶解曲線，用2-ΔΔCT法計算得出CDKN1A 的相對表達量。

1.6 數據統計 實驗結果均重復三次，數據用Graphpad Prism 5 軟件統計，計量數據以±s 表示。組間單因素采用One-way-ANOVA，雙因素采用Twoway-ANOVA，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 雷公藤甲素抑制KGN 活力 將KGN 以3×103個/孔接種于96 孔板，過夜預培養后，分別用2.5、5、10、20、40 及80 nmol/L 的雷公藤甲素處理KGN 24 及48 h，CCK-8 檢測雷公藤甲素對KGN 的細胞毒作用，結果顯示，雷公藤甲素處理24 h 后，KGN 活力在40 nmol/L 以上受到抑制(圖1A)，光鏡下也可以看出這種抑制作用(圖2B，40 nmol/L);而處理48 h 后，雷公藤甲素對KGN 活力的抑制呈劑量依賴性(圖1A)。

2.2 MSCs 的培養及鑒定 取回的新鮮臍帶經處理、培養，得到大量擴增的成纖維樣細胞(圖2A)。傳代后其免疫表型的檢測結果如圖2B 所示，CD29、CD44、CD90 及CD105 分子的表達呈陽性，CD31、CD34、CD45 及HLA-DR 的表達呈陰性，符合MSCs表面抗原的表達特征，經鑒定后確認為MSCs，其培養上清用于后續的實驗。

2.3 MSCs 上清可提高雷公藤甲素處理的KGN 細胞活力 為了獲取MSCs 的培養上清，我們先進行了MSC 預鋪板(按照MSC∶KGN=1∶5的比例)，過夜后更換完全培養基，24 h 后收集MSCs 上清。用CCK-8 法對KGN 的活力進行檢測，發現MSCs 上清對正常KGN 活力沒有明顯影響，而對雷公藤甲素損傷的KGN 活力有顯著提升(圖3)。

2.4 MSCs 上清可緩解雷公藤甲素對KGN 的S期阻滯 我們用PI染色法對KGN的周期分布進行了分析，分組同上，每組設置3 復孔。結果如圖4 所示，在雷公藤甲素的作用下，我們發現KGN 的細胞周期出現了明顯的S 期阻滯(Control 組:Dip G1:76.17%，Dip S:13.10%，Dip G2:10.73%;雷公藤甲素組:Dip G1:45.96 %，Dip S:47.11 %，Dip G2:6.927 %);而用MSCs 上清處理后，雷公藤甲素阻滯的KGN S 期細胞比例有所下降(MSCs 上清+雷公藤甲素組:Dip G1:54.35 %，Dip S:41.99 %，Dip G2:3.665 %)，說明MSCs 培養上清能夠減輕雷公藤甲素引起的S 期阻滯程度。此外，單獨MSCs上清作用不影響KGN 細胞周期(Dip G1:77.96%，Dip S:13.87%，Dip G2:8.170%)。

圖1 雷公藤甲素對KGN 活力的影響Fig.1 Effect of triptolide on cell viability of KGN

圖2 MSCs 的形態學觀察及免疫表型鑒定Fig.2 Morphological observation and immunophenotype identification of MSCs

圖3 MSCs 上清對雷公藤甲素處理的KGN 活力的影響Fig.3 Effect of MSCs conditioned medium on cell vitality of triptolide treated KGN

圖4 MSCs 上清對雷公藤甲素處理的KGN 周期的影響Fig.4 Effect of MSCs conditioned medium on cell cycle distribution of triptolide treated KGN

2.5 MSCs 上清減輕雷公藤甲素引起的周期阻滯與CDKN1A 有關 我們采用Real-time PCR 法檢測了p21 編碼基因CDKN1A 的表達，見圖5。結果表明，雷公藤甲素處理使KGN 的CDKN1A 表達呈現顯著上調，說明雷公藤甲素誘導的KGN S 期阻滯與CDKN1A 異常上調有關;同時，在雷公藤甲素處理過損傷的KGN 組中，MSCs 上清的作用在一定程度上降低了CDKN1A 的表達，但無顯著性差異。這提示，MSCs 上清可能通過調控雷公藤甲素導致的CDKN1A 異常表達而減輕雷公藤甲素引起的KGN S期阻滯。

圖5 MSC 上清對雷公藤甲素處理的KGN 表達CDKN1A的影響Fig.5 Influence of MSCs conditioned medium on expression of CDKN1A in triptolide treated KGN

3 討論

卵巢顆粒細胞參與了卵泡的發生以及激素合成，已有不少研究表明雷公藤具有生殖毒性，且有研究指出這可能與對卵巢顆粒細胞的損傷有關［6］，Chen 等［7］發現雷公藤能夠使卵泡顆粒細胞層減少，從而影響卵泡發育。此外，作為雷公藤的主要成分，雷公藤甲素對多種細胞都表現出抗增殖能力［9］，能下調結腸癌細胞的多種細胞因子受體及周期調控因子的表達，抑制VEGF 和COX-2 等分泌，從而調節結腸癌細胞周期進程、抑制其增殖及遷移［15］;Zhao等［16］研究表明雷公藤還能抑制卵巢癌細胞的侵襲，而且對其增殖的抑制具有劑量依賴性。這提示，作為雷公藤的主要成分，雷公藤甲素的毒性可能對卵巢顆粒細胞的生長產生影響。但是對大鼠卵巢顆粒細胞的研究表明，較低濃度的雷公藤甲素可以影響對雌二醇和孕酮的分泌，而對于其細胞活力沒有明顯影響［17，18］，這提示雷公藤甲素對人和鼠的卵巢顆粒細胞的影響可能存在濃度及種屬差別。我們用CCK-8 法檢測了雷公藤甲素對KGN 細胞活力的影響，發現雷公藤甲素能夠劑量依賴性地抑制KGN 活力(圖1A)，影響其細胞數目的增多(圖1B)。雷公藤甲素不僅影響細胞活力，還能夠造成多種細胞系的周期阻滯，比如對乳腺癌細胞系MDA-231 細胞及膽囊癌細胞系GBC-SD 及SGC-996 的S 期細胞周期阻滯［19，20］，對子宮內膜癌及卵巢癌細胞的S 期阻滯等［21］。我們對KGN 細胞周期進行了分析，發現雷公藤甲素同樣能夠引起KGN 的S 期阻滯(圖4)。

為探討MSCs 上清對雷公藤甲素損傷的KGN活力是否有影響，我們分離培養了臍帶來源MSCs，并對其免疫表型進行了檢測。MSCs 一般呈長梭形，表達CD29、CD44、CD90、CD105 分子，不表達造血系分子表型CD34 及CD45，內皮細胞標記物CD31 及人MHCⅡ類分子HLA-DR［22］。我們用混合酶消化結合貼壁法獲得的MSCs 形態均一，純度在90%以上，經流式細胞術檢測，其表面分子的表達符合MSCs 的普遍特征(圖2)。MSCs 能夠產生和分泌血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、血小板源生長因子(PDGF)及基質細胞衍生因子(SCF)等多種生長因子，具有營養與支持、免疫調節、抗凋亡抗體、促進血管生成等屬性［23］，能支持細胞的生長，促進卵巢損傷等組織修復。此外，MSCs 上清還可保護化療藥物對細胞的殺傷［24］。我們的實驗表明，雷公藤甲素損傷的KGN 在MSCs 上清作用下，其活力顯著高于損傷的對照(圖3)，進一步的細胞周期分析更顯示，MSCs 上清能夠顯著降低其S 期阻滯的阻滯程度(圖4)。

CDKN1A 是細胞周期負性調節因子p21 的編碼基因，p21 的過度表達提示細胞周期阻滯［25］。我們推測，雷公藤甲素引起的KGN 細胞S 期阻滯可能與CDKN1A 有關。實驗結果顯示，雷公藤甲素將KGN的CDKN1A 表達上調了約15 倍，此外，MSCs 上清的處理可以降低CDKN1A 的表達，雖沒有統計學差異，但這也提示了CDKN1A 可能與MSCs 上清緩解雷公藤甲素引起的KGN S 期阻滯程度有關(圖4)。

總之，我們的研究發現雷公藤甲素能夠直接抑制KGN 的活力，造成KGN 的S 期阻滯，從而抑制KGN 的生長，表現出對CDKN1A 的異常上調;而MSCs 上清則提高了雷公藤甲素損傷的KGN 的活力，降低了其S 期阻滯程度，同時還輕微降低了其CDKN1A 的表達。提示MSCs 上清可能減輕雷公藤甲素對KGN 細胞的損傷作用，這可能和影響CDKN1A 的表達有關。

［1］Edmonds SE，Montgomery JC.Reversible ovarian failure induced by a Chinese herbal medicine:lei gong teng［J］.BJOG，2003，110(1):77-78.

［2］郝 麗，盧 文，林 輝，等.雌孕激素替代治療雷公藤所致卵巢早衰的療效觀察［J］.中華腎臟病雜志，2005，21(3):143-145.

［3］史建輝，王敏捷，劉秀典.雷公藤致高促性腺激素閉經2 例［J］.中國新藥與臨床雜志，2003，22(10):635-636.

［4］Chen H，Li J，Cui T，et al.Adjuvant gonadotropin-releasing hormone analogues for the prevention of chemotherapy induced premature ovarian failure in premenopausal women［J］.Cochrane Database Syst Rev，2011(11):CD008018.

［5］Ginsburg J，Isaacs AJ，Gore MB，et al.Use of clomiphene and luteinizing hormone/follicle stimulating hormone-releasing hormone in investigation of ovulatory failure［J］.Br Med J，1975，3(5976):130-133.

［6］Chen X，Chen SL.A woman with premature ovarian failure induced by Tripterygium wilfordii Hook.f.gives birth to a healthy child［J］.Fertil Steril，2011，96(1):e19-21.

［7］Chen XY，Gu C，Ma M，et al.A mouse model of premature ovarian insufficiency induced by tripterygium glycoside via subcutaneous injection［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7(1):144-151.

［8］王桂玲，任春娥，王 麗.雷公藤多甙對雌性大鼠不良反應的實驗研究［J］.河北醫藥，2009，31(4):416-418.

［9］Zhou ZL，Yang YX，Ding J，et al.Triptolide:structural modifications，structure-activity relationships，bioactivities，clinical development and mechanisms ［J］.Nat Prod Rep，2012，29 (4):457-475.

［10］Le Blanc K.Immunomodulatory effects of fetal and adult mesenchymal stem cells［J］.Cytotherapy，2003，5(6):485-489.

［11］Uccelli A，Moretta L，Pistoia V.Mesenchymal stem cells in health and disease［J］.Nat Rev Immunol，2008，8(9):726-736.

［12］Caplan AI，Dennis JE.Mesenchymal stem cells as trophic mediators［J］.J Cell Biochem，2006，98(5):1076-1084.

［13］Sun M，Wang S，Li Y，et al.Adipose-derived stem cells improved mouse ovary function after chemotherapy-induced ovary failure［J］.Stem Cell Res Ther，2013，4(4):80.

［14］李威娜，謝琪璇，秦俊文，等.骨髓間充質干細胞對免疫損傷卵巢的修復作用［J］.南方醫科大學學報，2011，31(5):825-829.

［15］Johnson SM，Wang X，Evers BM.Triptolide inhibits proliferation and migration of colon cancer cells by inhibition of cell cycle regulators and cytokine receptors［J］.J Surg Res，2011，168(2):197-205.

［16］Zhao H，Yang Z，Wang X，et al.Triptolide inhibits ovarian cancer cell invasion by repression of matrix metalloproteinase 7 and 19 and upregulation of E-cadherin ［J］.Exp Mol Med，2012，44(11):633-641.

［17］Zhang J，Jiang Z，Mu X，et al.Effect of triptolide on progesterone production from cultured rat granulosa cells［J］.Arzneim Forsch Drug Res，2012，62(6):301-306.

［18］Zhang J，Liu L，Mu XM，et al.Effect of triptolide on estradiol release from cultured rat granulosa cells［J］.Endocr J，2012，59(6):473-481.

［19］Hu YP，Tan ZJ，Wu XS，et al.Triptolide induces s phase arrest and apoptosis in gallbladder cancer cells［J］.Molecules，2014，19(2):2612-2628.

［20］Liu J，Jiang Z，Xiao J，et al.Effects of triptolide from Tripterygium wilfordii on ERalpha and p53 expression in two human breast cancer cell lines ［J］.Phytomedicine，2009，16 (11):1006-1013.

［21］Li H，Takai N，Yuge A，et al.Novel target genes responsive to the anti-growth activity of triptolide in endometrial and ovarian cancer cells［J］.Cancer Lett，2010，297(2):198-206.

［22］Calloni R，Cordero EA，Henriques JA，et al.Reviewing and updating the major molecular markers for stem cells［J］.Stem Cells Dev，2013，22(9):1455-1476.

［23］Doorn J，Moll G，Le Blanc K，et al.Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells:paracrine effects and potential improvements［J］.Tissue Eng，2012，18(2):101-115.

［24］Konopleva M，Konoplev S，Hu W，et al.Stromal cells prevent apoptosis of AML cells by up-regulation of anti-apoptotic proteins［J］.Leukemia，2002，16(9):1713-1724.

［25］Zhang Y，Hu K，Hu Y，et al.Bone marrow mesenchymal stromal cells affect the cell cycle arrest effect of genotoxic agents on acute lymphocytic leukemia cells via p21 down-regulation［J］.Ann Hematol，2014，93(9):1499-1508.