益氣養(yǎng)陰活血法對膿毒血癥模型大鼠血清TNF-α、IL-6 與IL-10 的影響①

梁 群 刁冰冰 王 叢 (黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040)

膿毒癥(Sepsis)是機體在受感染后或在休克、創(chuàng)傷等應激狀態(tài)下自身免疫系統(tǒng)被過度激活致使大量炎性介質(zhì)失控性釋放，繼而引起的全身炎癥反應綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)［1］，因其常并發(fā)膿毒癥休克及多器官功能衰竭，成為各地醫(yī)院重癥監(jiān)護病房患者死亡的主要原因之一。目前對預測膿毒癥的發(fā)展方向和預后評估上臨床仍缺乏有效的手段，因此積極探索膿毒癥炎癥介質(zhì)和抗炎介質(zhì)濃度的變化，將為濃毒癥患者的疾病發(fā)展方向和預后評估提供新策略。在參與膿毒癥炎癥反應的炎癥介質(zhì)中，最為典型的炎癥介質(zhì)為白細胞介素(IL-6)，而且是導致膿毒癥患者組織損傷的重要因素。目前醫(yī)學界公認的炎癥抑制細胞因子則是白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)，它主要由Th2 細胞產(chǎn)生，因其具有良好的抗炎和免疫抑制特性而成為目前膿毒癥相關研究的主要炎癥因子［2］。本研究主要是觀察化纖膠囊(益氣養(yǎng)陰活血)對膿毒血癥模型大鼠血清TNF-α、IL6 與IL10 的影響從而對臨床上膿毒血癥患者的治療和相關炎癥介質(zhì)的變化給予提供幫助。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性和雌性Wistar 大鼠各45 只，體質(zhì)量為(150±20)g，提供單位為黑龍江省中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心，飼養(yǎng)環(huán)境清潔，自然光線采光，溫度(21±4)℃，相對濕度54%～76%，采用普通專用配比的飼料預養(yǎng)5 d 后進行實驗研究。

1.1.1 藥物化纖膠囊(10g/粒) 由黑龍江省中醫(yī)藥大學附屬一院制劑室制備，成分包含黨參、黃芪、丹參、當歸、太子參、沙參、麥門冬、蛤蚧等16 味中藥。血必凈注射液:每支10 ml，天津紅日藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號:國藥準字Z20110233。

1.1.2 血液標本采集 運用常規(guī)方法，存于抗凝試管中，充分搖勻，3 000 r/min，常溫離心15 min，后存放于-80℃冰箱內(nèi)保存標本。實驗前將標本復蘇于常溫下，采用同一批號試劑進行測定，血清TNF-α、IL-10 和IL-6 濃度用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定(TNF-α、IL-10 和IL-6 試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供，美國A＆D 公司生產(chǎn))，實驗步驟按標準流程操作。

1.2 造模及實驗方法

1.2.1 實驗用動物模型制備 采取禁食24 h 后以10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)進行腹腔注射麻醉。將大鼠四肢及牙齒捆綁以固定動物模型，取仰臥位于操作臺，用5%碘伏溶液以消毒動物模型，用75%酒精溶液給動物模型以脫碘。沿腹正中線切開腹部皮膚約2 cm，用1 號線采取盲腸結扎術(距盲端1～2 cm 處)結扎，在結扎處遠端采用18 號穿刺針穿刺盲腸2 至3 次，最后將盲腸納入腹腔后封閉腹腔，術后2 d 大鼠膿毒血癥模型造模完成。

1.2.2 實驗分組及給藥方法 將90 只大鼠隨機分成空白組(n=9)、膿毒癥組(模型組，n=9)、血必凈組(對照組，n=36)及化纖膠囊組(治療組，n=36)，血必凈組(對照組)和化纖膠囊組(治療組)又分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ6 個亞組，每組6 只。Ⅰ組實驗模型觀測CLP 術后7 d 的存活率，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ5 個亞組分別為CLP 術后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h組。空白組不造模，其余3 組均造模。造模2 d 后治療組給予化纖膠囊，1 次/d 口服;血必凈組(對照組)予血必凈1 次/d 靜脈注射;空白組與膿毒癥組(模型組)均灌等量生理鹽水，連續(xù)給藥7 d 直至檢查前24 h 停藥。

1.2.3 實驗標本的采集及檢測 在各規(guī)定的時間點上，直接在大鼠心臟處取4 ml 血并在血里加入乙二胺四乙酸，在4℃下的環(huán)境中用抗凝管以3 000 r/min 離心15 min 后，在-80℃冰箱內(nèi)保存上清液。采用ELISA-α 法檢測血清中TNF-α、IL-10 和IL-6的水平，操作流程按照試劑盒所附說明書步驟進行。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS18 統(tǒng)計軟件，計量資料以±s 表示，采用方差分析及χ2檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠7 d 生存率的比較 膿毒血癥組與化纖膠囊組的7 d 生存率分別為0 和83.33%。化纖膠囊組生存率明顯高于膿毒血癥組存活率，兩組比較差異明顯(P＜0.05)，證明具有統(tǒng)計學意義。

2.2 各組實驗模型的血漿TNF-α 水平比較 如表1 所示，膿毒癥組大鼠血清TNF-α 濃度快速升高，膿毒癥組大鼠6 h、12 h、24 h 血清TNF-α 濃度變化較空白組比較顯著升高，各時間點差異比較有統(tǒng)計學意義，經(jīng)過治療化纖膠囊組大鼠12 h、24 h 血清TNF-α 濃度較膿毒癥組顯著降低，差異比較顯示有統(tǒng)計學意義(表1)，對照組和治療組在治療效果上無統(tǒng)計學差異。

2.3 膿毒血癥組模型的血清IL-6 濃度動態(tài)變化 與空白組的濃度變化相比，膿毒血癥組大鼠血清IL-6 濃度在發(fā)病6 h、12 h 及24 h 快速升高，各時間點差異比較有統(tǒng)計學意義，化纖膠囊組大鼠12 h、24 h 血清IL-6 濃度與膿毒血癥組同時期濃度比較明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(表2)，對照組和治療組在治療效果上無統(tǒng)計學差異。

2.4 各組大鼠血漿IL-10 水平濃度動態(tài)變化 如表3 所示，膿毒血癥組與空白組比較，血漿IL-10 水平下降(P＜0.05);與膿毒血癥組比較，血必凈組IL-10 水平在CLP 后6 h 下降明顯，12 h 到達峰值，各時間點(除2 h 時點外)與膿毒血癥組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與膿毒血癥組比較，化纖膠囊組在6 h、12 h、24 h 及48 h 4 個時間點血漿水平IL-10 下降(P＜0.01)。

表1 各組血清TNF-α 濃度變化比較(±s，ng/ml)Tab.1 Comparison of serum TNF-α concentrations in each group(±s，ng/ml)

表1 各組血清TNF-α 濃度變化比較(±s，ng/ml)Tab.1 Comparison of serum TNF-α concentrations in each group(±s，ng/ml)

Note:Model group compared with blank group，1)P＜0.05;the treatment group compared with model group，2)P＜0.05.

表2 各組血清IL-6 濃度變化比較(±s，pg/ml)Tab.2 Comparison of serum IL-6 concentrations in each group(±s，pg/ml)

Note:Model group compared with blank group，1)P＜0.05;the treatment group compared with model group，2)P＜0.05.

表3 各組模型血清IL-10 水平變化比較(±s，ng/L)Tab.3 Comparison of serum IL-10 concentrations in each group(±s，ng/L)

表3 各組模型血清IL-10 水平變化比較(±s，ng/L)Tab.3 Comparison of serum IL-10 concentrations in each group(±s，ng/L)

Note:Model group compared with the control group，1)P＜0.01;the treatment group compared with model group，2)P＜0.01.

3 討論

本實驗選用盲腸穿刺結扎法(CLP)制備Wistar大鼠膿毒癥模型是因CLP 模型更接近臨床急性腸穿孔和腹膜炎的病發(fā)過程，能較真實地反映膿毒癥的病理生理變化使研究更具說服力，在膿毒癥過程的早期身體釋放炎癥因子，典型的如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6 等，機體以激活白細胞及凝血系統(tǒng)來阻止病原微生物的進一步擴散，表現(xiàn)以促炎癥反應為主。IL-10 等抗炎因子和可溶性TNF 受體，往往伴隨促炎因子的生成而過度產(chǎn)生，并且有對抗炎癥介質(zhì)的作用，防止過度炎癥反應的發(fā)生。炎癥介質(zhì)和抗炎介質(zhì)是決定在膿毒血癥過程中能否達到動態(tài)平衡的主要因素［3］。如果促炎反應占優(yōu)勢時，表現(xiàn)為免疫亢進或全身炎癥反應綜合征(SIRS)，使機體對外來打擊反應過于強烈，致使出現(xiàn)多臟器功能障礙綜合征(Multipleorgan dysfunction syndrome，MODS);當抗炎反應占優(yōu)勢時，則體現(xiàn)為代償性抗炎癥反應綜合征或免疫麻痹，使機體對外來打擊反應下降，對感染更為易感并且加重膿毒癥和MODS［3，4］。膿毒癥更易引發(fā)SIRS［5］若SIRS 進一步發(fā)展將誘發(fā)腦部疾病、腎功能不全，心肺功能受損等其他相關疾病，甚至部分或大部分功用喪失［6-8］，于是在炎癥反應的初期控制其發(fā)展和惡化，防止SIRS 的發(fā)生，將有利于縮短病程而且對減緩病情又有非常重要的臨床價值。目前醫(yī)學界研究顯示對炎性介質(zhì)的治療將為重癥膿毒血癥的治療提供新的對策，臨床資料顯示膿毒血癥患者存活率多少與炎性介質(zhì)密切相關，經(jīng)藥物治療的膿毒癥血癥患者血漿TNF-α、IL-6 水平下降則患者的存活率較高，反之，血漿TNF-α、IL-6 水平上升則患者的存活率較低。本研究表明，化纖膠囊(益氣養(yǎng)陰活血)能顯著降低膿毒血癥大鼠血漿TNF-α、IL-6 的水平，對膿毒血癥大鼠血漿IL-10 的水平下降不明顯，尚需進一步結合大樣本實驗研究觀察。

據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學研究顯示膿毒癥病因復雜，治療困難，病死率高是目前醫(yī)學界公認難以治愈的危重癥疾病之一，因此做到早發(fā)現(xiàn)、早治療膿毒癥是改善患者預后的關鍵。要從根本上提高膿毒癥患者生存率，則要從其發(fā)病機制的研究上尋找新的更有效的干預靶點［9，10］。中醫(yī)藥雖然對膿毒癥的治療有一定療效和創(chuàng)新，卻未能從分子生物學方面闡釋其作用機制，因此應用中藥治療膿毒癥并不能在國際上得到推廣。本實驗擬用“益氣養(yǎng)陰活血法”從益氣養(yǎng)陰和活血化瘀兩方面同時入手，系統(tǒng)研究益氣養(yǎng)陰活血方化纖膠囊對同時糾正免疫、炎癥方面在分子水平上的作用機制，運用中藥復方制劑早期多靶向治療，闡明該中藥防治膿毒血癥的作用機理。本實驗結果表明，化纖膠囊能降低膿毒癥大鼠病死率，值得在臨床工作中進一步推廣研究。

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