鼻咽癌基因選擇及基因治療的研究進展

丁 矢，張艷平，李雪蘭

（常德職業技術學院，湖南 常德 415000）

鼻咽癌（NPC）是一種多基因遺傳性疾病，其發生與遺傳、病毒感染、環境、飲食等多種因素有關，主要發生在中國南方及中國南方移民的后裔人群中，尤其以廣東省最為嚴重。我國發病率較歐美等國家高25～30倍，因此鼻咽癌又被稱為“中國癌”。目前其發病機制尚不十分清楚，治療效果亦不理想，5年生存率仍在50%～60%[1]。主要原因是其發病部位隱蔽，不易早期發現，且治療方式單一，缺乏特異治療藥物，傳統治療方法以放療為主，所以尋求一種新的治療方法迫在眉睫。隨著分子生物學的發展，腫瘤基因治療已成為新興的有效治療腫瘤的手段。目的基因的選擇及基因治療的方法和策略是腫瘤基因治療的兩個關鍵因素。利用與抗凋亡基因mRNA序列互補的特異性小分子干擾核糖核酸，作用于有凋亡抵抗的腫瘤細胞，阻斷其抗凋亡基因的表達，為調控腫瘤細胞凋亡提供了新的治療策略。

1 EBV 基因組在腫瘤中的存在特點

研究表明，在EBV（EB病毒）相關腫瘤組織中，EBV只感染癌細胞而不感染正常細胞，而在EBV陽性癌組織中，EBV基因組存在于幾乎所有的癌細胞中，提示EBV可能是治療EBV陽性腫瘤的理想靶點，因此可以利用EBV陽性腫瘤細胞與正常細胞的差異，采用適當方法選擇性地殺傷EBV陽性的腫瘤細胞[2]。腫瘤組織中EBV主要以潛伏感染的形式存在，不同EBV相關腫瘤組織中，病毒潛伏感染狀態不同，所表達的癌基因也不完全相同[3]。潛伏膜蛋白1（LMP1）是第一個被發現的病毒瘤基因，盡管100%的鼻咽低分化鱗癌存在EBV基因組，卻只有50%～60%的鼻咽癌組織表達LMP1，提示可能存在其他EBV瘤基因參與鼻咽癌的發生發展過程。

2 其他EBV 瘤基因在腫瘤中的作用

2.1 BHRF1 蛋白表達的作用

EBV裂解早期表達的蛋白BHRF1是近年來公認的導致細胞惡性轉化的病毒癌基因。BHRF1基因位于EBV基因組第54 376至54 951位核苷酸區域,全長576 bp,開放讀碼框有191個密碼子,編碼17kDa的蛋白質,屬于Bcl-2家族。該蛋白由約150個氨基酸組成的疏水性N末端、21個疏水性氨基酸組成的跨膜區以及兩個精氨酸組成的C末端構成。其中氨基端可以作為一個信號肽；羥基端的21個疏水性殘基與轉移膜固定序列相似，有兩個Asn-X-Thr/Ser序列，可以作為N-糖基連接的位點[4]。BHRF1蛋白有25%的氨基酸序列與人類原癌基因Bcl-2的編碼產物Bcl-2蛋白同源，42%的序列相似，而C區38%的氨基酸序列與Bcl-2序列同源。Henderson等曾用BHRF1表達載體pDH222轉染3種BL細胞系Wan-BL，Akata-BL和Raj-i BL，結果顯示，BHRF1能提高3種細胞在低血清培養基或含Ionomycin（離子霉素）培養基中的生存能力。Huang等為研究BHRF1表達在Co60照射后的鼻咽癌細胞中的抗凋亡作用，構建BHRF1高效表達載體轉染鼻咽癌細胞系CNE2，然后用流式細胞儀檢測Co60照射后細胞增殖和凋亡活性的改變。結果發現，照射前BHRF1的表達可以增加G1期細胞的數量，減少S期細胞的數量；照射后的BHRF1則能降低CNE2細胞的凋亡率，增加S期細胞的百分數。提示BHRF1的表達能改變細胞復制周期,提高CNE2細胞抵抗照射的能力。說明BHRF1蛋白在鼻咽癌細胞中的表達可增強細胞抵抗凋亡的能力，BHRF1基因的表達可抑制細胞的終末分化和細胞凋亡的發生。但BHRF1基因編碼的蛋白最終是通過何種途徑抑制細胞凋亡的發生，從而導致細胞癌變的分子機制目前還未完全闡明。

2.2 Bcl-2 蛋白表達的作用

雖然BHRF1與Bcl-2有高度同源序列（BH1區、BH2區和C末端），但兩種基因編碼N末端部分（即BHRF1的BH3區、BH4區與Bcl-2的BH3區）氨基酸序列有不同的蛋白,提示BHRF1和Bcl-2可能具有不同的功能。BHRF1與Bcl-2的另一不同點是翻譯后的修飾不同，Bcl-2在體內以磷酸化形式存在,這種磷酸化修飾對Bcl-2的調節功能非常重要，而BHRF1具有兩個潛在的N-糖基化修飾位點,說明BHRF1同靶分子的作用方式與Bcl-2不同。BHRF1缺少Bcl-2家族其他成員共有的用于結合促凋亡家族成員的暴露的疏水性溝槽結構。此外，與Bcl-2蛋白相反，BHRF1并未與促凋亡蛋白Bak、Bax、Bik和Bad的肽段緊密結合，提示其抗凋亡作用機制與細胞癌基因Bcl-2或Bcl-xl不同。BHRF1并非EBV體外誘導B細胞轉化及病毒復制所必需基因，但從自然界不同來源的EBV基因中都能檢測到BHRF1基因序列，而且其編碼的氨基酸序列和抗凋亡活性高度保守，因此推測BHRF1抗凋亡功能對病毒生命周期至關重要，即可能通過延長感染細胞的生存時間，有利于病毒的大量繁殖和建立持續性感染。在本項目前期預實驗中，結果顯示BHRF1基因在本研究所選用的人鼻咽癌CNE2細胞株過表達，FCM檢測CNE2細胞BHRF1陽性率為56.8%，將構建的攜帶BHRF1的慢病毒載體轉染無血清培養的CHO細胞，細胞凋亡時間明顯延長，這與國內文獻的報道較一致。鑒于EBV早期基因BHRF1可導致細胞癌變，并且與抗凋亡基因協同作用參與EBV相關腫瘤的發生發展，提示BHRF1基因很可能成為鼻咽癌基因治療較為理想的選擇性干預的靶基因。

3 RNA 干涉抑制鼻咽癌相關基因的表達

RNA干涉（RNA interference，RNAi）是近年來發現的一種重要的轉錄后基因沉默（Post-Transcriptional Gene Silencing，PTGS）技術，它通過內源性或外源性雙鏈小分子干擾RNA片段介導，在基因轉錄水平上特異性降解具有相應序列的mRNA，從而導致轉錄水平的基因沉默，它是一個十分有效的基因敲除的方法。這一現象最先發現于隱桿線蟲中，現已證明存在于各種生物如植物、果蠅及哺乳動物中。近年用RNAi技術在多種不同的腫瘤細胞中成功干擾了多種靶基因的表達，這些基因包括癌基因、抗凋亡分子、端粒酶、生長因子受體、某些信號分子以及其他的一些基因，抑制了腫瘤細胞的生長，已成為目前腫瘤治療的研究熱點。伴隨著對其作用機理的研究，發現RNAi具有高特異性、高效性、高穿透性、可遺傳性等特點，能夠簡單、高效地抑制特定基因的表達，適用于低等動物及高等動物[5]。它不僅是研究基因功能的一種有力工具，而且為特異性基因治療提供了新的技術手段，有廣泛的應用潛能。目前制備siRNA的方法有：化學合成法、體外轉錄法、體外消化法、siRNA表達載體法，其中前3種方法是在體外制備siRNA，通過轉染或電轉的方法將它導入細胞中，這使siRNA抑制作用時間短，且成本昂貴，并且易因污染RNAs酶而被降解，所以其應用受到限制。RNA聚合酶III依賴性啟動子U6和HL-RNA可轉錄產生小發夾RNA（shorthairpin RNA，shRNA），即轉錄產生同時含有RNA正義鏈（19～23nt）、回折片段（1～7nt）和反義鏈（19～23nt）的小RNA，經分子內配對形成19～23nt的小發夾RNA[6]。由此介導的RNA干涉不僅可避免上述缺點，還可獲得較好的基因抑制效果。另外，經過合適的抗藥性篩選，還可獲得干涉質粒穩定整合入基因組的永久干涉細胞克隆。病毒癌基因的細胞轉化作用導致了病毒相關腫瘤的發生和發展，說明理論上RNAi技術可將選擇性沉默腫瘤細胞內病毒癌基因用于病毒相關腫瘤的治療是可行的。也有研究表明，survivin基因的過表達會抑制腫瘤細胞對放、化療的敏感性[7]。Yang等利用腺病毒載體介導的siRNA轉染非小細胞性肺癌，通過干擾降低了survivin基因的表達，從而加強了該細胞對放療的敏感性。提示RNAi技術可選擇外源性病毒基因為靶點，成為病毒陽性腫瘤基因治療的新途徑。

4 結語

基因載體的選擇與構建合適的載體系統是基因治療的關鍵。由于病毒基因組結構簡單，分子背景比較清楚，易于改造和操作，感染效率高，有較高靶細胞特異性，所以在以基因治療為目的的載體系統中，病毒載體就顯得格外令人關注。雖然脂質體較病毒載體有許多優越性，它的轉導無需受體，無免疫源性，安全性高且制備簡單，但主要缺點是外源基因表達短暫。借鑒病毒對哺乳動物細胞具有感染性，人們構建了各種有效的病毒轉基因系統。逆轉錄病毒載體雖可使目的基因整合至靶細胞基因組，實現穩定表達，但只能轉導分裂細胞，主要用于基因治療的離體方案；腺病毒載體既能轉導分裂細胞，亦可轉導靜止細胞，轉導效率也較高，但目的基因不整合至靶細胞基因組，僅能短暫表達，而且腺病毒本身的某些抑制缺陷型逆轉錄病毒載體是以HIV21為基礎發展而得，原表達可引起DC成熟。慢病毒載體能夠轉染非分裂期細胞和分裂期細胞，而且病毒的遺傳物質能夠整合到宿主的基因組，慢病毒載體RNAi作用持久，免疫反應小，同時擴大了載體感染細胞的范圍，適于體內基因治療[8]。本研究旨在利用RNAi技術，以慢病毒為載體，將負載BHRF1的shRNA的慢病毒載體轉染至人鼻咽癌CNE2細胞后，觀察其對BHRF1基因沉默及細胞增殖和凋亡的影響以及腫瘤細胞對放射敏感性的變化，進一步闡明BHRF1對腫瘤細胞的抗凋亡機制，從而為臨床治療鼻咽癌提供新的理論依據。

[1]Setton J，Wolden S，Caria N，et al. Definitive treatment of metastatic nasopharyng ealcarcinoma: Report of 5 cases with review of literature[J].Head Neck，2012，34（5）：753-757.

[2]Li Z，Chen X，Li L，et al.EBV encoded miR-BHRF1-1 potentiates viral lytic replication by down regulating host p53 in nasopharyngeal carcinoma[J].Int J Biochem Cell Biol，2012，44（2）：275-279.

[3]Kim do N，Song YJ，Lee SK. The role of promoter methylation in Epstein-Barr virus （EBV）microRNA expression in EBV-infected B cell lines[J].Exp Mol Med，2011，43（7）：401-410.

[4]Jing YZ，Wang Y，Jia YP，et al.Polymorphisms of Epstein-Barr virus－BHRF1gene，a homologue of bcl-2 [J].Chin J Cancer，2010，29（12）：1000-1005.

[5]Xing L，Kieff E. Epstein-Barr Virus BHRF1 micro and stable RNAs during latency III and after induction of replication [J].J Virol，2007，81（18）：9967-9975.

[6]Kim do N，Chae HS，Oh ST，et al.Expression of viral microRNAs in Epstein-Barr Virus associated gastric carcinoma [J].J Virol，2007，81（2）：1033-1036.

[7]Landais E，Saulquin X，Bonneville M，et al.Long-term MHC class II presentation of the EBV lytic protein BHRF1 by EBV latently infected b cells following capture of BHRF1antigen [J].J Immunol，2005，175（12）：7939-7946.

[8]Pratt ZL，Kuzembayeva M，Sengupta S，et al. The microRNAs of Epstein-Barr Virus are expressed at dramatically differing levels among cell lines[J].Virology，2009，386（2）：387-397.■