VEGF-D在口腔鱗癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的表達(dá)研究

劉 英，莫金龍，劉 震，唐婉容

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，四川 南充 637000；2.遂寧市中心醫(yī)院信息科，四川 遂寧 629000 )

鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是口腔腫瘤中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占90%以上，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是口腔癌早期常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移途徑，其轉(zhuǎn)移率高達(dá)37%～58%，是導(dǎo)致早期口腔鱗癌治療失敗的重要原因[1]。近年來(lái)，腫瘤微環(huán)境日益成為研究熱點(diǎn)，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞與癌上皮細(xì)胞的交互作用在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[2]。在實(shí)體腫瘤微環(huán)境中，成纖維細(xì)胞是數(shù)目眾多、功能強(qiáng)大、獲得活化表型的間質(zhì)細(xì)胞，被稱(chēng)為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAFs) 。CAFs通過(guò)其產(chǎn)生的多種生長(zhǎng)因子以及趨化因子影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[3-4]。已有研究表明CAFs分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在促進(jìn)口腔癌血管生成及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中起作用，本研究旨在探究CAFs是否促進(jìn)淋巴管的生成，在口腔癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中是否起作用。

1 材料和方法

1.1 用于原代人口腔鱗癌CAFs培養(yǎng)的標(biāo)本收集

收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科原發(fā)性O(shè)SCC患者組織，所有患者術(shù)前均未行化療、放療和其他生物治療，所有標(biāo)本均由病理科確診。所取組織包括癌鄰近結(jié)締組織用于CAFs分離培養(yǎng)，手術(shù)邊界正常結(jié)締組織用于NFs分離培養(yǎng)。手術(shù)標(biāo)本切取過(guò)程中嚴(yán)格無(wú)菌操作，取材后立即放入含有雙抗的磷酸鹽緩沖液中，在超凈臺(tái)內(nèi)修剪完成后續(xù)操作(標(biāo)本信息見(jiàn)表1 )。

表1 用于原代CAFs培養(yǎng)的標(biāo)本信息

1.2 人口腔CAFs和NFs的分離培養(yǎng)及鑒定

運(yùn)用CAFs組織塊分離培養(yǎng)方法，在超凈臺(tái)內(nèi)修剪組織，取鄰近癌上皮的結(jié)締組織和手術(shù)邊界正常的結(jié)締組織分別用于CAFs和NFs的分離培養(yǎng)。用眼科剪將組織剪成1 mm3左右的小塊，用含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL的PBS液漂洗3次，用眼科鑷送入培養(yǎng)瓶，用牙科探針將組織塊在瓶底上均勻擺置。加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司產(chǎn))，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2飽和濕度，3～5 d換液。0.25%胰酶消化傳代，差速消化法對(duì)CAFs進(jìn)行純化，得到第3代純化細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)用6代以?xún)?nèi)的細(xì)胞[3，6]。

1.3 細(xì)胞組化鑒定口腔CAFs

胰酶消化細(xì)胞后，均勻接種至細(xì)胞爬片上，加培養(yǎng)基2 mL，培養(yǎng)2～3 d，觀察細(xì)胞鋪滿(mǎn)爬片40%～60%，用4%多聚甲醛固定后用于細(xì)胞組化染色檢測(cè)。固定細(xì)胞用0.5% TxitonX-100處理后，在相同條件下采用SP法試劑盒進(jìn)行免疫組化染色，以PBS作為陰性對(duì)照，每例樣本組每個(gè)指標(biāo)設(shè)3個(gè)平行細(xì)胞爬片染色。采用鼠抗人cytokeratin、vimentin、α-SMA、VEGF-D抗體檢測(cè)，其中cytokeratin、vimentin、α-SMA購(gòu)自北京中杉金橋試劑公司，一抗稀釋度分別為1∶200、1∶200、1∶100；VEGF-D購(gòu)自Abcam，一抗稀釋度為1∶200。同時(shí)結(jié)合觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)方式，對(duì)生長(zhǎng)至第3代的細(xì)胞進(jìn)行初步鑒定。

1.4 RT-PCR檢測(cè)CAFs表達(dá)VEGF-D的mRNA水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分別提取CAFs和NFs的RNA，參照試劑盒說(shuō)明(TakaRa)每例樣本組設(shè) 3 個(gè)平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。VEGF-D引物為上游5’-AGC TGG GGA AGA GTA CCA ACA-3’，下游為5’-CAC AGA GAG CTG GTT CCT GGA-3’，以β-actin基因作為內(nèi)參。采用RT-PCR 儀自帶分析軟件分析各樣品mRNA表達(dá)情況，相對(duì)定量采用 2-ΔΔCT法計(jì)算。通過(guò)計(jì)算CT值的方法對(duì)VEGF-D mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人口腔CAFs的分離培養(yǎng)及鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察，CAFs生長(zhǎng)速度較快，細(xì)胞排列無(wú)序，密度和接觸抑制喪失，細(xì)胞體和細(xì)胞核均較大。正常成纖維細(xì)胞NFs排列規(guī)則，無(wú)重疊生長(zhǎng)，密度和接觸抑制保留，胞體和胞核較小。通過(guò)細(xì)胞組化染色，原代培養(yǎng)的CAFs和NFs 細(xì)胞均表達(dá)Vimentin，而不表達(dá)Cytokeratin，這證明無(wú)論是CAFs還是NFs均為成纖維細(xì)胞來(lái)源，而非上皮細(xì)胞來(lái)源。CAFs表達(dá)α-SMA，染色陽(yáng)性，證明是生物學(xué)特性已經(jīng)發(fā)生變化的癌旁成纖維細(xì)胞，見(jiàn)圖1、圖2。

2.2 細(xì)胞免疫組化染色顯示人口腔CAFs、NFs表達(dá)VEGF-D 的差異

細(xì)胞爬片組化染色的陽(yáng)性抗原定位準(zhǔn)確，背景著色淺或無(wú)，顏色鮮明，二者的比值大于1(陽(yáng)性/背景)，(HRP-DAB/H2O2)則表現(xiàn)為淡黃色細(xì)顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆粒，染色強(qiáng)度分“弱(+)、中(++)、強(qiáng)(+++)”3級(jí)。細(xì)胞免疫熒光法(FITC為例)則表現(xiàn)為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠眼熒光；后者耀眼易見(jiàn)。

VEGF-D免疫染色陽(yáng)性物質(zhì)主要存在于胞漿，陽(yáng)性染色表現(xiàn)為淺淡黃色細(xì)顆粒，熒光染色陽(yáng)性表現(xiàn)為綠色熒光。NFs、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CAFs、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CAFs均表達(dá)VEGF-D陽(yáng)性，但CAFs表達(dá)高于NFs，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CAFs又明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CAFs。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，染色強(qiáng)度趨勢(shì)一致(圖3代表1次染色結(jié)果)。

2.3 用RT-PCR檢測(cè)VEGF-D mRNA在CAFs、NFs 的表達(dá)

采用Quantitative Real-time PCR檢測(cè)VEGF-D mRNA 在 CAFs和NFs的表達(dá)，采用 2-ΔΔCT法以β-actin為內(nèi)參基因，計(jì)算其表達(dá)值。用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析。可見(jiàn)VEGF-D的mRNA在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CAFs明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表2與圖4。

表2 NFs、CAFs表達(dá)VEGF-D mRNA均值

*P<0.05，與NFs組比較；#P<0.05，與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CAFs組比較。

3 討論

口腔癌發(fā)病率較高，位居全身惡性腫瘤的第6位。鱗狀細(xì)胞癌是口腔腫瘤中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占90%以上，治療后5年生存率仍然徘徊在50%左右。頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是口腔癌早期常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移途徑，其轉(zhuǎn)移率高達(dá)37%～58%，只要有同側(cè)或?qū)?cè)單個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其生存率會(huì)降低50%左右，這是導(dǎo)致早期OSCC治療失敗的重要原因[5]。所以，OSCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)于其預(yù)后評(píng)估和治療方法的選擇具有重要意義。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與微環(huán)境密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)的相互作用，既保證其生存又促進(jìn)其向惡性發(fā)展和轉(zhuǎn)移。在實(shí)體腫瘤的微環(huán)境中，成纖維細(xì)胞是最豐富的一類(lèi)細(xì)胞，已有大量研究表明，腫瘤微環(huán)境中的CAFs與正常成纖維細(xì)胞不同，已經(jīng)發(fā)生表型及功能的改變，在介導(dǎo)OSCC的發(fā)生、調(diào)節(jié)發(fā)展、促進(jìn)血管生成及調(diào)控免疫信號(hào)等方面起核心作用[6-9]。但對(duì)于CAFs在口腔鱗癌淋巴管生成的作用卻少有研究。因此，本課題旨在探究CAFs是否促進(jìn)淋巴管的生成，在OSCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中是否起作用。

淋巴管在腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移中起著重要作用。首先，在腫瘤生長(zhǎng)早期，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要靠彌散方式及微淋巴管提供；其次，腫瘤淋巴管是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要途徑 。VEGF是調(diào)節(jié)血管生成的最重要因子之一，在腫瘤新生血管生成中起著重要的作用。VEGF-C/D是淋巴管生成因子，能誘導(dǎo)腫瘤淋巴管的生成，進(jìn)而促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。已有研究表明VEGF-C在乳腺癌、前列腺癌、肺癌組織中增高表達(dá)，并對(duì)促進(jìn)淋巴管轉(zhuǎn)移有作用[10-12]。VEGF-D基因定位于性染色體Xp22.31上，全場(chǎng)50 kb，1998年由Achen等確認(rèn)為VEGF家族中的新成員。Karnezis等[13]在對(duì)乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF-D能促進(jìn)前列腺素的分泌，擴(kuò)張淋巴管，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴管的轉(zhuǎn)移(Cancer Cell，2012)。對(duì)于口腔CAFs是否分泌VEGF-D，是否促進(jìn)OSCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移目前未見(jiàn)有相關(guān)研究。

在本研究中，我們首先用組織塊培養(yǎng)法獲得口腔CAFs，用差速胰酶消化法純化細(xì)胞，3～4代CAFs能很好的純化而沒(méi)有癌上皮細(xì)胞的污染。用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，用cytokeratin、vimentin、α-SMA進(jìn)行表達(dá)蛋白的鑒定，發(fā)現(xiàn)CAFs與NFs相比，生長(zhǎng)增殖速度快，密度抑制和接觸抑制喪失，細(xì)胞排列無(wú)序；Vimentin、α-SMA 染色均為陽(yáng)性，Cytokertain染色為陰性，具有CAFs的基本生物學(xué)特性。對(duì)所獲得的CAFs和NFs細(xì)胞進(jìn)行VEGF-D的細(xì)胞免疫組化和免疫熒光的對(duì)比研究，證明了CAFs和NFs均表達(dá)VEGF-D，但CAFs表達(dá)高于NFs，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CAFs高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CAFs。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)VEGF-D mRNA的表達(dá)量，用2-ΔΔCT法計(jì)算與內(nèi)參基因β-actin的比值，分別為0.806 7±0.117、1.192 5±0.125、2.085 3±0.131。結(jié)果顯示，VEGF-D mRNA表達(dá)水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CAFs明顯升高。以上實(shí)驗(yàn)初步證明了口腔CAFs分泌VEGF-D較NFs有所升高，其表達(dá)水平升高可促進(jìn)口腔鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

口腔CAFs能夠影響腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，通過(guò)增加分泌VEGF、VEGF-D促進(jìn)OSCC的血管和淋巴管轉(zhuǎn)移，顯示其在口腔癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用[14-15]。CAFs靶向腫瘤治療旨在對(duì)其進(jìn)行特異性生物學(xué)干擾，同時(shí)抑制其在腫瘤發(fā)生發(fā)展各方面的介導(dǎo)作用。這既可以干擾腫瘤進(jìn)展轉(zhuǎn)移的能力，又可以克服針對(duì)癌細(xì)胞治療的耐藥性。本研究?jī)H對(duì)CAFs表達(dá)VEGF-D進(jìn)行了研究，對(duì)其調(diào)控機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)均有待深入研究。

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