利用分光光度法間接測(cè)定海水中的羥胺*

盧光遠(yuǎn) 宋秀賢 俞志明

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

氮是海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要的生源要素, 含氮化合物在微生物酶的作用下發(fā)生著多種生物地球化學(xué)過程(Brandeset al, 2007)。以往的研究者常關(guān)注于海水中以及CO(NH2)2含量的測(cè)定, 對(duì)微量還原性羥胺等含氮化合物關(guān)注不足。羥胺作為硝酸鹽異化反硝化、厭氧氨氧化和銨鹽第一步硝化作用的中間產(chǎn)物在氮的生物地球化學(xué)循環(huán)中扮演著重要角色(胡安輝等, 2010; Vajralaet al, 2013),同時(shí)在生物代謝中羥胺作為還原態(tài)化合物成為氫的供體(史云峰等, 2007; Brandeset al, 2007)。羥胺具有較強(qiáng)的還原性, 且沒有顯色劑直接與羥胺基團(tuán)形成具有一定特征顯色的物質(zhì)(肖松濤等, 2008), 因此間接測(cè)定便成為一種可行之策。目前, 測(cè)定羥胺的方法主要有碘量滴定法、電化學(xué)法、光度法、色譜法等(楊明, 1999; 詹國(guó)慶等, 2004; Seikeet al, 2004; 孫桂進(jìn)等, 2006; 李京雄等, 2013; Vajralaet al, 2013), 以上方法均因操作繁瑣、顯色時(shí)間長(zhǎng)、顯色不穩(wěn)定、儀器昂貴等問題未能得到廣泛應(yīng)用。鹽酸羥胺作為還原劑常被用于土壤間隙水、海水、污水等水體中鐵含量的測(cè)定(馮媛媛等, 2004; 郝新煥, 2006; 遲光宇等, 2008); 而硫酸鐵銨-鄰菲羅啉法已被用于土壤中羥胺還原酶活性的測(cè)定(史云峰等, 2007), 且該法已被證實(shí)在復(fù)雜體系中具有較高的準(zhǔn)確度和精密度(楊明, 1999; 史云峰等, 2007), 而在海水中未見羥胺測(cè)定的應(yīng)用報(bào)道。基于此, 本文應(yīng)用硫酸鐵銨-鄰菲羅啉法測(cè)定羥胺還原等量三價(jià)鐵離子濃度的原理間接獲得海水中的微量羥胺含量, 對(duì)該方法的適用性進(jìn)行了系統(tǒng)檢驗(yàn)評(píng)價(jià), 并測(cè)定了天然海水培養(yǎng)東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)藻液中羥胺的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器: T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

試劑: 1.0523g鹽酸羥胺定容至500mL, 配制成濃度為1000mg/L羥胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液, 于4°C冷藏, 使用前臨時(shí)配制10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液。緩沖溶液選取pH值為4.5左右的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液(1mol/L+1mol/L), 氧化劑為硫酸鐵銨(4.0mmol/L), 顯色劑為鄰菲羅啉-乙醇溶液(0.01mol/L)(史云峰等, 2007)。滅菌天然海水(取自匯泉灣, 121°C高溫滅菌20min), 東海原甲藻藻液及0.45μm混合纖維膜過濾液備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)原理 弱酸性條件下, 羥胺能將Fe3+還原為Fe2+(公式1), Fe2+與鄰菲羅啉(簡(jiǎn)稱phen)生成橙紅色配位化合物(公式2), 此絡(luò)合物較為穩(wěn)定(楊明,1999)。可見光譜510nm處具有較強(qiáng)的吸收峰, 通過測(cè)定絡(luò)合物吸光值獲得Fe2+濃度(楊明, 1999), 扣除本底中Fe2+濃度后間接獲得微量羥胺濃度。

1.2.2 工作曲線 分別取10mg/L羥胺標(biāo)準(zhǔn)使用液0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00mL于100mL容量瓶中, 配制成濃度梯度依次為0.020、0.050、0.100、0.200、0.400、0.600、0.800mg/L的溶液, 取2.5mL至1cm比色皿中, 分別依次加入乙酸鈉-乙酸緩沖溶液、硫酸鐵銨溶液和鄰菲羅啉-乙醇溶液各0.1mL, 混合搖勻顯橙紅色, 30min后在510nm、溫度20oC下測(cè)定其吸光值, 每組設(shè)四重樣(史云峰等,2007), 用超純水作參比, 所有數(shù)據(jù)均為扣除空白值。

1.2.3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 取滅菌天然海水2.5mL分別添加0.02、0.10、0.20mL羥胺標(biāo)準(zhǔn)使用液, 每組設(shè)四重樣, 以滅菌天然海水作為空白參比, 其他條件同上, 最后濃度計(jì)算時(shí)需進(jìn)行體積校準(zhǔn)。

1.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取滅菌天然海水2.5mL分別添加0、0.10mL羥胺標(biāo)準(zhǔn)使用液, 搖勻顯色后分別在10、30、60、120、180、1080、1440min進(jìn)行測(cè)定, 每組設(shè)四重樣。

1.2.5 藻液實(shí)驗(yàn) 分別取已破碎藻液及0.45μm膜過濾藻液2.5mL進(jìn)行以上測(cè)定, 每組設(shè)四重樣。

1.3 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

對(duì)間接測(cè)定方法進(jìn)行準(zhǔn)確度、檢測(cè)限和方法重復(fù)性評(píng)價(jià)(曹雁平等, 2012)。利用標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)等參數(shù)評(píng)價(jià)方法的精準(zhǔn)度。在進(jìn)行兩組或多組數(shù)據(jù)變異程度比較時(shí), 因?yàn)槠骄挡煌? 比較其變異程度不能采用標(biāo)準(zhǔn)偏差, 而要對(duì)相對(duì)值進(jìn)行比較, 即變異系數(shù)比較, 又稱相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

方法檢測(cè)限評(píng)價(jià): 通常以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差與檢出限附近校正曲線斜率k的商計(jì)算檢出限, 即它表示被測(cè)組分濃度改變一個(gè)單位時(shí)分析信號(hào)的變化量, 即靈敏度。

方法重復(fù)性評(píng)價(jià)采用臨界極差法。針對(duì)多個(gè)測(cè)試結(jié)果(n≥2)時(shí), 將結(jié)果極差(測(cè)量結(jié)果最大值與最小值之差)與臨界極差CrR0.95(n)進(jìn)行比較,CrR0.95(n)=f(n)Sr, 對(duì)于四次平行檢測(cè), 由中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 11792-89中(國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局, 1989)臨界極差系數(shù)f(n)表查得f(4)=3.6, 任一實(shí)驗(yàn)結(jié)果最大濃度與最小濃度極差小于或等于臨界極差, 則認(rèn)為檢測(cè)方法的重復(fù)性較好(李慎安, 2006; 吳孟浩, 2012)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥胺工作曲線

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 該分光光度間接測(cè)定法在羥胺濃度為0.020—0.800mg/L范圍內(nèi), 其濃度與吸光值具有顯著的線性相關(guān)性(y=0.2696x+0.003,R2=0.9996,P＜0.0001,n=32, 圖1)。即使放置24h后吸光值有所升高, 但羥胺濃度與吸光值依然保持顯著的線性相關(guān)性(y=0.3256x+0.0082,R2=0.9951,P＜0.0001,n=32),說明該方法顯色在24h內(nèi)具有較好的線性穩(wěn)定性。顯色30min后吸光值測(cè)量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.70%—5.13%, 平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.65%; 測(cè)量濃度與設(shè)定濃度間的相對(duì)誤差為-2.63%—5.71%, 平均相對(duì)誤差為1.30%(表1)。

圖1 羥胺溶液工作曲線Fig.1 The working curve of hydroxylamine

表1 羥胺標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定的準(zhǔn)確性Tab.1 The accuracy of hydroxylamine in standard solution

2.2 海水加標(biāo)回收試驗(yàn)

為了解緩沖體系是否適合海水樣品, 分別將海水與緩沖液(乙酸鈉-乙酸)按照50︰1、33.3︰1、25︰1、20︰1、12.5︰1體積比進(jìn)行混合, 測(cè)得其pH值依次為4.55、4.51、4.50、4.49、4.48, 再添加硫酸鐵銨后,pH值分別為4.56、4.52、4.50、4.49、4.48。以上結(jié)果說明, 在本研究實(shí)驗(yàn)條件下該反應(yīng)體系pH值較為穩(wěn)定, 適于海水樣品測(cè)量。利用添加標(biāo)準(zhǔn)羥胺的溶液與滅菌天然海水為空白進(jìn)行差值比較, 計(jì)算添加0.20、1.00、2.00μg羥胺的回收率分別達(dá)到105.9%、108.1%、106.8%, 平均回收率達(dá)到106.9%, 平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.71%(表2)。該結(jié)果表明, 在滅菌天然海水中添加一定濃度羥胺具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表2 海水中外加羥胺的回收率Tab.2 The recovery of hydroxylamine added in seawater

2.3 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化及穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)比滅菌天然海水穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn), 添加標(biāo)準(zhǔn)羥胺溶液不影響顯色時(shí)間, 顯色均在30—120min保持穩(wěn)定(P=0.6224＞0.05,n=12), 超過120min會(huì)出現(xiàn)吸光值升高現(xiàn)象, 差異性顯著(P＜0.0001,n=24), 這可能是顯色物質(zhì)受到其他微量有色金屬的干擾所致, 而在1440min后吸光度出現(xiàn)較大增長(zhǎng)(圖2)。所以, 選擇反應(yīng)時(shí)間在30—120min的穩(wěn)定期內(nèi)進(jìn)行測(cè)量。顯色干擾在以往研究中時(shí)有發(fā)生: 如海水鐵元素測(cè)量中銅、鈷、鎳等有色絡(luò)合物離子的共存可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)后期的顯色, 而在溶液中添加10倍于羥胺濃度的硝酸銀、亞硝酸銀、氯化銨均對(duì)溶液吸光度無影響(楊明, 1999;詹國(guó)慶等, 2004; 李京雄等, 2013)。但在乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中, 小于等于10倍鐵濃度的銅、鋅、鈷、鉻及小于2mg/L的鎳不會(huì)干擾鐵的測(cè)定(郝新煥,2006), 而具有較強(qiáng)還原性的肼可能會(huì)對(duì)羥胺的測(cè)定有一定影響(楊明, 1999; 肖松濤等, 2008)。據(jù)此判斷本研究間接測(cè)定法需在120min顯色穩(wěn)定期內(nèi)測(cè)定完畢, 以避免其他潛在物質(zhì)的干擾。

圖2 海水及添加羥胺后的反應(yīng)穩(wěn)定性Fig.2 The reaction stability of hydroxylamine in seawater

2.4 藻液中羥胺濃度

將破碎后的東海原甲藻原藻液與0.45μm混合纖維膜過濾后的藻液按照上述方法進(jìn)行羥胺濃度的測(cè)定(表3), 發(fā)現(xiàn)過濾后藻液中羥胺的濃度約為0.021mg/L, 接近最低檢測(cè)限, 而破碎藻液中羥胺總含量為0.291mg/L (相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.60%), 據(jù)此推測(cè)羥胺主要存在于藻細(xì)胞內(nèi)部, 從而驗(yàn)證了羥胺是在藻細(xì)胞內(nèi)部合成, 是藻細(xì)胞利用銨鹽轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的重要中間體。

表3 東海原甲藻藻液中羥胺濃度Tab.3 Hydroxylamine concentration in Prorocentrumdonghaiense solution

2.5 海水中羥胺分光光度間接檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

利用公式計(jì)算該方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測(cè)樣濃度極差、變異系數(shù)和檢出限(李慎安, 2006; 吳孟浩, 2012),結(jié)果如表4。其中標(biāo)準(zhǔn)偏差Sr值較低, 由此可確定該方法的精確度較高; 而變異系數(shù)CV值偏低反映出該方法在檢測(cè)低濃度羥胺時(shí)其離散性較低; 檢出限D(zhuǎn)最低達(dá)0.021mg/L, 相當(dāng)于0.6μmol/L NH2OH, 說明該方法具有較高的分辨率, 但對(duì)于痕量級(jí)羥胺測(cè)定需進(jìn)一步優(yōu)化; 4個(gè)實(shí)驗(yàn)的4次平行檢測(cè)的最大濃度與最小濃度極差分別為0.0037、0.0111、0.0148、0.0111mg/L, 均小于各自的重復(fù)性臨界極差CrR0.95(n)值0.0067、0.0168、0.0231、0.0168mg/L, 說明該方法的重復(fù)性很好(曹雁平等, 2012)。

表4 間接分光光度檢測(cè)羥胺法的評(píng)價(jià)Tab.4 The evaluating parameters of the indirect hydroxylamine method

本研究只針對(duì)同一操作者在不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間和測(cè)樣條件下進(jìn)行的重復(fù)性檢測(cè), 并未針對(duì)不同測(cè)樣人員和儀器進(jìn)行復(fù)現(xiàn)性檢測(cè)(李慎安, 2006)。該方法適于樣品初始pH值在1.5—9.5范圍內(nèi), 由于測(cè)試用樣品體積較小, 無法獲知鹽度、溫度等因素對(duì)檢測(cè)限的影響, 對(duì)于海水中更低含量羥胺濃度的測(cè)定需要進(jìn)一步優(yōu)化。同時(shí), 針對(duì)不同的測(cè)量樣品需進(jìn)行特定空白校準(zhǔn)。

3 結(jié)論

海洋生態(tài)系統(tǒng)中, 羥胺可與多種離子發(fā)生氧化還原反應(yīng), 同時(shí)可與金屬發(fā)生配位, 在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄中會(huì)作為化學(xué)誘變劑使堿基對(duì)發(fā)生改變, 引起基因突變。所以, 研究羥胺的測(cè)定方法不僅對(duì)獲得海洋中羥胺的轉(zhuǎn)化過程至關(guān)重要, 更為了解氮的生物地球化學(xué)循環(huán)提供了物質(zhì)佐證。本研究結(jié)果表明: 硫酸鐵銨-鄰菲羅啉分光光度間接法可用于測(cè)定海水中濃度范圍在0.020—0.800mg/L的羥胺, 其平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.65%, 平均相對(duì)誤差為1.30%, 通過添加標(biāo)準(zhǔn)物發(fā)現(xiàn)該方法具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性, 測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可信。該方法顯色穩(wěn)定時(shí)間在30—120min內(nèi)無顯著差異(P=0.6224＞0.05,n=12)。測(cè)定東海原甲藻藻液含量驗(yàn)證了羥胺在藻細(xì)胞內(nèi)部合成, 是藻細(xì)胞利用銨鹽轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的重要中間體。通過方法不確定度的系統(tǒng)評(píng)價(jià)得出該方法精確度較高, 檢測(cè)時(shí)離散性低, 具有較高的分辨率、重復(fù)性, 不需要特殊儀器, 且簡(jiǎn)捷易行。

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