吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)幼魚日糧中添加植酸酶替代磷酸二氫鈣的效果研究*

馮 健 吳 彬 王 斐 彭 淇 陳 斌 李 曉

(廣西大學海洋研究中心 南寧 530004)

在水產飼料中蛋白質原料為主要成分與成本支出, 魚粉為傳統的的蛋白質主要原料, 具有營養全面均衡、誘食性好、養殖效果好的特點。但世界魚粉資源有限、價格昂貴, 已經成為影響全球水產養殖的一個主要問題。以大豆粕為代表的植物性蛋白原料, 具有資源豐富、價格低廉的特點, 目前在水產飼料蛋白質原料中廣泛用于替代魚粉等動物性原料(Chenet al,2013)。但大豆粕等植物蛋白原料的主要不足之一, 為植物蛋白原料中存在著一些營養抑制成分, 影響飼料的消化利用。其中植酸為主要的營養抑制成分之一,植物性蛋白原料中的磷大多數與植酸螯合為植酸磷,導致植物性蛋白質原料中磷的利用低下, 植酸還能與鈣、鎂、鋅、氨基酸和淀粉等形成難以消化的絡合物, 導致飼料中多種營養消化率下降(Kaushiket al,1995; 黃遵錫等, 1999; Franciset al, 2001)。在一些動物的植物性為主的飼料中添加植酸酶分解植酸磷,可以明顯提高磷的利用率和生長效益, 減少飼料中磷礦物質添加, 減少對環境的污染, 目前植酸磷已經廣泛應用于畜禽飼料(Madridet al, 2013; Lalpanmawiaet al, 2014; Rutherfurdet al, 2014)。

羅非魚系鱸形目(Perciformes)、麗魚科(Cichlidae)、羅非魚屬(Tilapia), 屬熱帶性魚類, 為世界性的主要養殖魚類之一, 我國產量已達約150萬t, 占世界總量的40%左右。在羅非魚飼料中, 較多添加大豆粕等植物性蛋白原料, 全面研究在羅非魚植物性蛋白質原料為主的飼料中添加植酸酶的效果, 對于提高飼料中磷的利用率和養殖效益, 減少養殖水域的磷排泄量與污染具有重要意義。為此, 作者進行了相關研究, 目的為在植酸酶在羅非魚等水產飼料中的應用提供理論與實踐依據。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚與管理

實驗用魚為從廣西水產研究所國家羅非魚良種繁育場購得1500尾吉富羅非魚魚苗, 用5%左右的生理鹽水消毒后, 放暫養池暫養, 暫養期間投喂普通商業羅非魚魚苗飼料。暫養一周后, 挑選活力好、體質健壯、規格大小均勻的420尾魚苗為實驗魚, 平均體重為(1.9±0.1)g, 每個實驗組分3個平行, 7個組, 共21個尼龍網箱, 每個尼龍網箱里放20尾魚苗, 網箱規格為1m×0.5m×1m, 網箱放置在規格為12.0m×3.0m×1.5m 的室內水泥池中。在網箱中架設食臺,食臺直徑為15cm, 高3cm。

整個養殖期間采用微流水模式進行水交換, 水泥池每天換水量不超過三分之一, 養殖期間通過每天測3次水溫對水溫進行實時監測, 通過每周測一次水質對水體狀況進行監測。養殖期間水質監測情況如下: 水溫(31.4±3.3)°C, pH 7.1±0.2, 溶解氧(8.33±0.29)mg/L, 氨氮(0.51±0.02)mg/L, 亞硝酸鹽(0.159±0.03)mg/L, 硝酸鹽(0.100±0.011)mg/L。

養殖期間, 通過魚體體重估算投喂量, 以魚體重的10%—6%稱每天的投料量, 投喂時間為9:00、18:00, 每天兩次, 每天投喂前把飼料平均分成兩份,投飼時采取由慢到快再逐漸變慢的投料方式將飼料投入食臺內, 認真觀察實驗魚的活力和攝食情況, 投料后3min后, 若食臺上仍有殘余的飼料, 則立即結束投喂, 撈出食臺上的殘餌, 記錄殘餌數量與每天的余料量, 然后進行統計。養殖期間, 每隔2周對所有魚進行稱重, 調整投喂量。養殖實驗持續60d, 為室內水泥池養殖, 屋頂為透明塑料, 光周期為自然周期。

1.2 各試驗組基礎日糧組成

魚粉、魚油、大豆粕、次粉、復合多維、復合多礦、磷酸二氫鈣、氯化膽堿由廣西百洋飼料公司提供;微晶纖維素為鄭州博軒化工產品有限公司提供; 植酸酶為北京華農生物工程有限公司提供, 酶活力為2000U/g。

各個實驗組的日糧組成和近似成分見表1, 實驗日糧的營養標準、復合多維、復合礦物含量是參考NRC羅非魚的營養標準進行設定的(NRC, 1993)。對照組以魚粉作為主要蛋白源, 不添加磷酸二氫鈣; 其它實驗組以大豆粕為主要蛋白源, 分別添加2.5%、2.0%、1.5%、1.0%、0.5%、0%磷酸二氫鈣制作6組實驗日糧, 共設計7組等氮(35.69%)、等能量(15.95kJ/g)的半純合日糧, 記為實驗組1(對照組)、實驗組2(替代0%磷酸二氫鈣)、實驗組3(替代20%磷酸二氫鈣)、實驗組4(替代40%磷酸二氫鈣)、實驗組5(替代60%磷酸二氫鈣)、實驗組6(替代80%磷酸二氫鈣)、實驗組7(替代100%磷酸二氫鈣)。本實驗日糧總磷為0.77%以上, 設計目的是研究植酸酶分解日糧中植酸磷與利用效果。

表1 實驗日糧組成和近似成分(%)1)Tab.1 Composition of the experimental diets and proximate constituent (%)

飼料原料經過粉碎后, 過40目篩, 隨后按照飼料配方設計的比例和實際制作量進行稱重, 復合多維、復合多礦、氯化膽堿等微量成分采取逐級擴大法添加, 待混合均后, 逐一加入微晶纖維素和磷酸二氫鈣、魚粉等大宗飼料原料攪拌混勻, 植酸酶先用微晶纖維素混合擴大法添加, 最后加入魚油和水, 再次均勻混合, 用小型飼料顆粒機進行制粒, 制成的顆粒飼料直徑為2.5mm, 于鼓風干燥箱中65°C恒溫烘干,用密封塑料袋進行密封存放, 并置冰箱–20°C中保存直至投喂。

1.3 樣品的采集與檢測方法

實驗開始前, 分別從每種飼料原料和每組實驗日糧中抽取部分樣品用于測定主要營養成分。對各個網箱的魚進行計數和稱重。實驗結束時, 對各個網箱的魚記數、稱重, 計算其存活率和特定生長率。通過每天的余料量和殘餌量, 計算每個網箱的投喂量和飼料效益。試驗結束前兩周采用虹吸法將糞便粒吸出移到培養皿, 然后用鑷子將包膜完整的糞便轉移到另一干凈的培養皿中, 用濾紙濾去水分, 75°C烘干粉碎后置于–20°C冰箱保存以測定各組實驗魚糞便中的總磷含量。

實驗結束后, 從每個實驗組3個平行網箱中隨機各取2尾魚, 共6尾魚, 分別稱重, 烘干, 用于全魚組分分析; 從每實驗組3個平行網箱中隨機取3尾魚,共9尾魚, 分別稱魚重, 量體長, 然后解剖取整個內臟團稱重, 取肝臟和剝離腸脂稱重, 用于計算肝體指數和腸脂指數。分別從每個實驗組3個平行網箱中隨機各取2尾魚, 共6尾魚, 剝取魚的鱗片和魚骨, 用于測定鈣磷的沉積。取魚的骨時, 在解剖魚之后將魚體放入沸騰的開水中煮10min左右, 以魚肉可以從魚體剝離為準, 把肌肉剝盡, 洗刷干凈魚骨上的肌肉,干燥后稱重保存待用。相關計算公式如下(Halveret al,2002):

成活率(SR, %) = 試驗結束魚尾數/試驗開始魚尾數×100;

攝食量(FI, g) = 投喂量–殘留量;

特定生長率(SGR, %/t) = (lnWf–lnWi)×100/t;

飼料效率(FER, %) = (Wf–Wi) / FI×100。

式中,Wi試驗開始時魚體重(g);Wf試驗結束時魚體重(g);t養殖試驗天數(d); FI攝食量;Wt魚體重;Wb內臟質量;Wh肝臟質量;Wi腸系膜脂肪質量。

從每個試驗組隨機各取12尾魚, 分別稱重, 解剖, 剝離肝臟稱重, 計算肝體指數, 剝離腸脂稱重,計算腸脂指數。基礎飼料與魚體(每組6尾)中的近似成分分析(水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量)按AOAC(1990)有關標準方法測定, 磷與植酸磷含量按國家標準(GB/T 18634, 2009)方法測定, 飼料總糖含量采用減量法(總干重減去蛋白質、脂肪和灰分含量)計算而得。肝體指數與腸脂指數相關計算公式如下(Halveret al, 2002):

肝體指數(HSI, %) =Wh/Wt×100; 腸脂指數(ISI,%) =Wi/Wt×100

式中,Wf試驗結束時魚體體重;Wh試驗結束時魚體肝臟質量;Wi試驗結束時魚體腸系膜脂肪質量。

1.4 實驗數據處理和分析

采用SPSS19.0數據統計軟件包對實驗各組間數據進行統計分析, 試驗結果經過一元方差分析(Oneway ANOVA)后, 用平均數±標準差表示。先進行方差齊性分析, 方差齊性則運用LSD法進行單因素方差多重比較, 方差非齊性則采用Tamhane’s T2法進行單因素方差分析, 顯著水平采用0.05。然后進行Duncan’s多重比較各實驗組間差異的顯著性,P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 實驗各組魚的存活率、飼料攝食量、生長性能和飼料效率

實驗各組的末體重、體長、存活率、特定生長率和飼料效益見表2。從表2中可以看出, 各實驗組魚的存活率之間均無顯著性差異(P＞0.05), 日糧中不同有效磷對其成活率無明顯影響。在特定生長率與飼料效益方面, 實驗組1魚顯著高于其它實驗組(P＜0.05),表明日糧中添加魚粉的生長效果與飼料效益明顯高于大豆粕; 實驗組2與3、4魚組間無顯著差異(P＞0.05),均顯著性高于實驗組5、6、7組魚(P＜0.05), 表明在日糧中添加植酸酶一定程度上提高了日糧中磷的利用率, 一定程度上減少了日糧中磷酸二氫鈣的添加。

表2 實驗各組魚的體重、攝食量、存活率、特定生長率和飼料效益Tab.2 The weight, feed intake (FI), survival ratio, specific growth rate (RGR) and feed effectiveness rate (FER) in fish

2.2 實驗各組魚體的臟體指數、肝體指數、腸脂指數和肥滿度

實驗各組魚體的臟體指數、肝體指數、腸脂指數和肥滿度結果見表3。從表3中可以看出, 在肥滿度方面, 實驗組1與其它6個實驗組之間存在顯著性差異(P＜0.05), 顯著高于其它6個實驗組, 而其它6個實驗組相互之間沒有顯著性差異(P＞0.05)。在肝體指數方面, 實驗各組組間無顯著性差異(P＞0.05)。在腸脂指數方面, 實驗組1、2、3與實驗組4組間無顯著性差異(P＞0.05); 但實驗組魚6、7組顯著性高于實驗組1、2、3、4魚(P＜0.05)。在臟體指數方面, 實驗組1魚的臟體指數顯著低于其它6個實驗組(P＜0.05), 實驗組2與實驗組3之間無顯著性差異(P＞0.05); 實驗組5、7魚顯著性差異高于實驗組2、3、4組魚(P＞0.05)。表明當日糧中有效磷不足時, 腸脂指數上升, 從而使臟體指數增加。

2.3 實驗各組魚的近似成分分析

實驗各組魚體的水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分結果見表4。從表4中可以看出, 各實驗組魚體的水分和粗灰分組間無顯著性差異(P＞0.05)。在粗蛋白含量方面, 實驗組1魚體顯著性高于其它實驗組; 而實驗組2、3、4組顯著性高于實驗組5、6 (P＜0.05)。在粗脂肪方面, 實驗組1魚體顯著性低于其它實驗組;而實驗組2、3、4組顯著性低于實驗組5、6、7(P＜0.05)。表明隨著日糧中有效磷減少, 魚體脂肪含量上升, 而蛋白質含量下降。

表3 實驗各組魚的肝體指數、腸脂指數、臟體指數和肥滿度Tab.3 The hepatosomatic indices (HSI), intestinalsomatic indices (ISI), viscerasomatic indices (VSI) and fatness in fish

表4 實驗各組魚魚體的主要營養成分(%) (n=6)Tab.4 The main nutrients of fish in the experimental groups (%) (n=6)

2.4 實驗各組魚全魚中鈣、磷的沉積

實驗各組全魚鈣、磷含量結果見表5。從表5可以看出實驗組1全魚鈣、磷含量顯著高于其它實驗組魚、實驗組2、3、4魚顯著高于實驗組5、6、7魚, 實驗組5、6魚顯著高于實驗組7(P＜0.05)。表明日糧中有效磷含量與全魚鈣、磷含量呈正比。

表5 實驗各組魚魚體的磷含量和鈣含量(%) (n=6)Tab.5 The phosphorus and calcium contents of fish in experimental groups (%) (n=6)

2.5 鈣、磷在實驗組魚鱗片和魚骨中的沉積

各實驗組魚骨和鱗片鈣、磷含量結果見表6。從表6中可以看出, 實驗組1魚骨和鱗片鈣、磷含量顯著高于其它實驗組魚、實驗組2、3、4魚顯著高于實驗組6、7魚, 實驗組7最低(P＜0.05)。表明日糧中有效磷含量也與魚骨和鱗片鈣、磷含量呈正比。

2.6 實驗各組日糧植酸磷含量與糞便磷含量

實驗各組日糧植酸磷含量與糞便磷含量見表7。從表7中可以看出, 實驗組1日糧中植酸磷含量顯著低于其它實驗組日糧, 而糞便磷含量顯著高于其它實驗組日糧(P＜0.05); 而其它實驗組日糧中植酸磷含量組間無顯著性差異(P＞0.05); 實驗組2魚糞便磷含量顯著高于實驗組3—實驗組7。表明在日糧中添加植酸酶(2000U/kg日糧), 能夠有效分解日糧中的部分植酸磷, 降低了糞便中磷含量。

表6 實驗各組魚脊椎骨中磷含量、鈣含量和鱗片中磷含量、鈣含量(%) (n=6)Tab.6 The phosphorus and calcium contents of fish vertebras and scales in experimental groups (%) (n=6)

表7 實驗各組日糧植酸磷含量與糞便磷含量(%)Tab.7 The phytate phosphorus and phosphorus contents of diets and feces in experimental groups (%)

3 討論

3.1 日糧中添加植酸酶替代磷酸二氫鈣對吉富羅非魚養殖效果的影響

本實驗結果表明, 日糧無論用魚粉蛋白原料還是大豆粕蛋白原料對實驗魚的成活率均沒有顯著性影響。但魚粉的養殖效果明顯優于大豆粕, 大豆粕并不能完全替代魚粉。作者在吉富羅非魚稚魚實用日糧中, 用大豆粕替代魚粉的研究也表明, 大豆粕雖然能替代大部分的魚粉, 但大豆粕中的營養抑制物質和必需氨基酸的含量偏低是影響養殖效果的主要原因(趙海祥等, 2011)。本實驗結果表明, 日糧中有效磷含量與吉富羅非魚稚魚蛋白質合成率呈正比, 當日糧主要蛋白質原料為魚粉時, 魚體脂肪含量較低, 而蛋白質較高。另外, 魚粉組吉富羅非魚稚魚的攝食量明顯高于大豆粕, 說明大豆粕的適口性明顯低于魚粉,導致生長較慢與飼料效益較低。實驗2組日糧中有效磷高于實驗3、4組20%和40%, 但與后兩組魚在特定生長率和飼料效益方面無顯著性差異, 表明日糧添加植酸酶對提高羅非魚的生長率、飼料效益方面有良好的效果, 可以部分替代磷酸二氫鈣, 這也在一些報道中證實(賀建華, 2005; Biswaset al, 2007; Limet al, 2009; 周金敏等, 2012)。實驗組3—實驗組7的糞便磷含量較實驗組2均有顯著性下降, 表明日糧中添加植酸酶可以在羅非魚消化道中一定程度分解植酸磷, 提高了植物原料中磷的消化率。Miranda等(2000)也報道在無魚粉飼料中添加植酸酶可以提高尼羅羅非魚幼魚生長和飼料利用效率。

3.2 添加植酸酶替代磷酸二氫鈣對吉富羅非魚鈣、磷沉積與排泄的影響

鈣和磷作為魚體的必需常量元素, 是魚生長所必不可少的。研究鈣、磷的沉積可以知道魚體中鈣、磷的利用情況。魚骨和鱗片是魚體鈣磷沉積與代謝的主要組織。本實驗結果表明, 日糧中添加植酸酶增加了魚體中鈣、磷含量與魚骨和鱗片中磷沉積, 起到了部分替代磷酸二氫鈣的作用。黃峰等(2007)也認為,在飼料中添加植酸酶對草魚全魚魚體的磷含量有顯著的提高。Liebert等(2007)的實驗中表明添加植酸酶對鈣、磷在鱗片和脊椎的成分中影響顯著。由于磷的利用率增加, 鱗片與脊椎的灰分和磷在鱗片與脊椎的灰分中的含量都增加。Yan等(2002)也報道添加植酸酶對魚鱗片和脊椎骨灰分有明顯的提高。

魚類腸道中缺少能分解植酸磷的植酸酶, 故其基本上不能在其腸道中吸收利用, 只能排到水體中,進而污染養殖水體。本實驗結果表明, 日糧中添加植酸酶后魚糞便中磷含量下降了大約35%—45%左右,明顯減少了養殖水體富營養化, 所以不僅可以節約無機磷的添加, 還可以避免水體的污染。但是日糧中仍有60%左右的植酸磷未被分解利用, 這在其它一些研究中也曾報道, 其原因值得進一步研究(Johanneet al, 2009; Hassaanet al, 2013; Zhuet al, 2014)。

綜上所述, 在本實驗條件下, 日糧添加植酸酶(添加量為日糧0.1%的植酸酶(酶活2000U/kg日糧)可以替代40%左右的磷酸二氫鈣。

周金敏, 劉行彪, 周 櫻, 2012. 植酸酶替代磷酸二氫鈣對斑點叉尾飼料消化率和磷代謝的影響. 飼料工業, 14(1):43—46

趙海祥, 馮 健, 寧 毅等, 2011. 大豆粕替代魚粉在吉富羅非魚稚魚實用飼料中的效果評價. 動物營養學報, 10(12):1840—1846

賀建華, 2005. 植酸磷和植酸酶研究進展. 動物營養學報, 5(1):1—6

黃 峰, 劉 軍, 胡先勤等, 2007. 飼料中添加植酸酶對草魚魚種生長性能和磷利用率的影響. 中國飼料, 16(1): 31—33

黃遵錫, 章克昌, 1999. 植酸酶基礎與應用研究概況. 食品與發酵工業, (2): 56—60

GB/T 18634, 2009. 中華人民共和國國家標準, GB/T 18634-2009

AOAC (Association of Official Analytical Chemists), 1990.Official Methods of Analysis (15thedn.). Arlington, VA,USA: 65—72

Biswas A K, Kaku H, Cheol Set al, 2007. Use of soybean meal and phytase for partial replacement of fish meal in the diet of red sea bream,Pagrus major. Aquaculture, 267(1—4):284—291

Chen R, Zhang C, Yao Bet al, 2013. Corn seeds as bioreactors for the production of phytase in the feed industry. Journal of Biotechnology, 165(2): 120—126

Francis G, Makkar H P S, Becker K, 2001. Antinutrirional factors present in plant-derived alternate fish feed ingredients and their effects in fish. Aquaculture, 199: 197—227

Halver J E, Hardy R W, 2002. Fish Nutrition. third edition.Academic Press, London, 36—38

Hassaan M S, Soltan M A, Agouz H Met al, 2013. Influences of calcium/phosphorus ratio on supplemental microbial phytase efficiency for Nile tilapia (Oreochromis niloticus). The Egyptian Journal of Aquatic Research, 39(3): 205—221

Johanne D, Kim S E, Per B Pet al, 2009. Effect of supplemented fungal phytase on performance and phosphorus availability by phosphorus-depleted juvenile rainbow trout(Oncorhynchus mykiss), and on the magnitude and composition of phosphorus waste output. Aquaculture, 286:105—112

Kaushik S J, Cravedi J P, Sumpter Jet al, 1995. Partial or total replacement of fish meal by soybean protein on growth,protein utilization, potential estrogenic or antigenic effects,cholesterolemia and flesh quality in rainbow trout,Oncorhynchus mykiss. Aquaculture, 133: 257—274

Lalpanmawia H, Elangovan A V, Sridhar Met al, 2014. Efficacy of phytase on growth performance, nutrient utilization and bone mineralization in broiler chicken. Animal Feed Science and Technology, 192: 81—89

Liebert F, Portz L, 2007. Different sources of microbial phytase in plant based low phosphorus diets for Nile tilapiaOreochromis niloticusmay provide different effects on phytate degradation. Aquaculture, 267(1—4): 292—299

Lim S J, Lee K J, 2009. Partial replacement of fish meal by cottonseed meal and soybean meal with iron and phytase supplementation for parrot fish (Oplegnathus fasciatus).Aquaculture, 290(3—4): 283—289

Madrid J, Martínez S, López Cet al, 2013. Effect of phytase on nutrient digestibility, mineral utilization and performance in growing pigs. Livestock Science, 154(1—3): 144—151

Miranda E C, Pezzato A C, Pezzato L Eet al, 2000. Availability of calcium: phosphorus ratio in diets for Nile tilapia(Oreochromis niloticus). Rev Bras Zoo Technology, 29:2162—2171

NRC (National Research Council), 1993. Nutrient Requirements of Fish. National Academy Press, Washington, DC, USA,114

Rutherfurd S M, Chung T K, Moughan P J, 2014. The effect of dietary microbia phytase on mineral digestibility determined throughout the gastrointestinal tract of the growing pig fed a low-P, low-Ca corn-soybean meal diet. Animal Feed Science and Technology, 189: 130—133

Yan W, Reigh, R C, 2002. Effects of fungal phytase on utilization of dietary protein and minerals, and dephosphorylation of phytic acid in the alimentary tract of channel catfishIctalurus punctatusfed an all-plant-protein diet. World Aquaculture Soc, 33(1): 10—22

Zhu Y, Qiu X, Ding Qet al, 2014. Combined effects of dietary phytase and organic acid on growth and phosphorus utilization of juvenile yellow catfishPelteobagrus fulvidraco. Aquaculture, 430: 1—8