納米粒子應用于微生物檢測的研究進展

陶珊珊, 李云霞, 趙 琨, 陳雯雯, 趙 渝

(1.上海師范大學 生命與環境科學學院 上海 200234; 2.上海師范大學 植物種質資源開發中心,上海 200234)

近幾年來,世界范圍內的食品安全惡性事故頻繁爆發[1],食源性疾病的爆發率大幅上升已引起了世界各地政府的關注,更給世界人民帶來了巨大的痛苦和損失.因而,如何快速、靈敏地檢測出食源性致病菌的存在已成為控制食品安全問題的關鍵.傳統的食源性疾病的檢測方法都要經過分離培養、生化鑒定等步驟,存在操作耗時繁瑣、檢測靈敏度低和容易出現假陰性等缺點[2],在應對突發性食品安全公共事件上,不能滿足快速、準確、靈敏和特異性高等要求.近幾十年來,納米粒子技術在食源性致病菌的檢測領域不斷發展[3-4].本文作者主要從熒光納米粒子、磁性納米粒子等方面介紹了納米粒子在微生物致病菌快速檢測中的應用.

1 光學納米粒子快速檢測技術

熒光納米粒子由于其具有的化學及光學特性,能產生較高的靈敏度,已經被許多課題研究小組用于微生物菌劑的檢測[5-6].

1.1 金納米粒子

金納米粒子是較受歡迎的納米材料.依賴其獨特光學特性,以及在生物液體里的惰性和穩定性使它成為納米粒子材料診斷中最常用的材料之一.金納米粒子(AuNPs)廣泛被應用于微生物分析、檢測和識別領域.通過選擇合適的合成方法,可以很容易地形成不同大小和形狀的金納米粒子.AuNPs很容易被硫醇化的DNA探針和蛋白質分子修飾[1](圖1),這一特點使它優于其他類型的納米粒子.金納米粒子的另一獨特特性是呈現出明顯的紅色,這使診斷測驗的敏感性增強,可視性高.此外,金納米粒子常用于免疫層析試紙條(ICS)生物傳感器[7](圖2).

ICS已經實現對傳染性病原體及毒素的快速、靈敏檢測.目標菌和金納米粒子聚合成紅色沉淀,診斷測試中,不需要任何儀器的協助,仍可很容易地看清目標反應,在測試區,檢測線為紅線,可視化很高[8].同時,金納米粒子具有較高的消光系數,以及在可見光中具有較寬的吸收光譜,可以克服許多傳統熒光素的局限性[9].Zhu研究小組開發了一個混合了金、銀2種納米粒子的局部表面等離子體共振生物傳感器,用于金黃色葡萄球菌腸毒素B檢測.這種傳感器可直接檢測腸毒素B至ng/mL級別,而用于檢測腸毒素B的其他表面等離子體共振生物傳感器則需要采取擴增的步驟來實現這一目標靈敏度[11].

圖1 金納米粒子與硫醇化DNA分子結合原理圖[1]

圖2 免疫層析試紙條用于微生物檢測原理[10]

1.2 熒光硅納米顆粒

熒光檢測試驗對于微生物學家并不新鮮,因為熒光顯微鏡和分光熒光計廣泛應用于診斷和實驗室研究.熒光硅納米顆粒容易被生物修飾并可通過熒光顯微鏡或分光熒光計來檢測微生物[12].摻雜二氧化硅納米粒子的染料可以用來探測生物分子,比其他熒光納米顆粒具有更高的靈敏度[13].

單個熒光二氧化硅納米粒子可保留數千染料分子,而在免疫熒光測定抗體的直接熒光標記中只有極少數染料分子.因此,利用二氧化硅納米粒子可以提高檢測靈敏度達幾百倍.此外,相比于其他熒光納米粒子,染料中摻雜的二氧化硅納米顆粒具有光穩定性和增強發光的優點.它們已被廣泛地用于生物分子的檢測,例如asDNA、抗體、細胞等[14].

二氧化硅納米粒子可保留有機或者金屬染料,該染料可以附著在納米顆粒的表面或包含在納米粒子內部.用于成像的納米顆粒嵌入染料分子后,可免受光的照射,表現出更強的耐光性[15].納米顆粒可以很容易被抗體或者核酸分子化學功能化和生物修飾化,經化學修飾后的納米顆粒表面生成的氨基或羧基基團能夠使熒光納米粒子共價連接抗體[16].包被的染料熒光納米顆粒與抗體結合后,增強了測定的靈敏度,使檢出限降低到單個細胞水平[17].這種檢測方法對一些苛刻性細菌或者生長比較緩慢的細菌檢測非常有利.例如結核桿菌,該菌需要很長的培育時間和特殊的培養條件.Qin研究組曾使用熒光二氧化硅納米顆粒靈敏地從細菌混合物及標準唾液樣品中檢測出結核分枝桿菌,結核分枝桿菌結合到A蛋白上,A蛋白被摻雜有二氧化硅納米粒子的聯吡啶釕(RuBpy)修飾[14].另外,在佛羅里達大學的Tan課題研究小組使用熒光二氧化硅納米顆粒檢測單一樣品中的多種細菌.該納米粒子包含不同濃度的染料分子,被同一波長激發后會產生不同的顏色.通過綴合不同細菌對應的抗體的納米粒子能夠檢測樣品中的3種細菌,每種細菌對應一種顏色[12].

1.3 量子點

在過去的20年里,半導體納米顆粒及量子點的光電子特性以及在生命科學研究中的應用備受研究者的關注,主要應用于生物檢測[18].量子點是納米級的半導體晶體,具有獨特的光學特性,作為熒光標記物可用于免疫分析、DNA雜交試驗及微生物檢測[19].

大部分用于檢測細菌的光學生物傳感器是基于對有機染料或者蛋白質熒光團熒光排放量的測量.然而,常見的熒光團具有較多的缺點[20](如微弱的耐光性和低強度),且不適用于多種細菌的檢測.量子點可以克服這些限制,它們具有光穩定性,且表現出高量子產率[21].通過改變量子點的尺寸和它的化學組成可以使其發射光譜覆蓋整個可見光區,故可使用量子點同時檢測多個細菌[22].Zhao等使用連接上抗體的量子點與MNPS能夠同時檢測出鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏桿菌、大腸桿菌O157:H7[23].相比傳統有機染料(如異硫氰酸熒光素),量子點可有效提高測定的靈敏度,這一優勢通過簡單的熒光測定大腸桿菌O157:H7血清型即可表現出才來.Liu研究小組發現了基于流動室微孔免疫濾鏡的生物傳感器的發展系統,這種傳感器以量子點樹枝石納米晶體作為熒光標記[24],可用來捕捉大腸桿菌O157:H7,使用這種生物傳感器系統,檢測限可低至2.3 CFU/mL.Abdelhamid等使用殼多糖修飾的CdS量子點標記細菌進一步用于生物成像[7].Xu等構建了連接有量子點的免疫層析試紙條,用于快速檢測空腸彎曲桿菌,檢測限達到104cfu/mL,是金試紙條檢測靈敏度的10倍[25].

1.4 上轉換發光納米粒子

上轉換熒光材料是在長波長的激發下,發出短波長光的一類熒光材料.它們大多屬于稀土摻雜的無機材料,如鐿、鉺共摻雜的氟化釔、氟化釔鈉、氟化鑭等.上轉換熒光納米材料在980 nm紅外光激發下,能發出不同顏色的可見光,與傳統的熒光物質相比,上轉換納米熒光材料作為熒光材料探針,干擾小,具有較高的信噪比、良好的耐光以及檢測靈敏度高[26].上轉換熒光材料多用于生物熒光標記和生物成像[27]等方面.Qu等構建了一種上轉熒光材料免疫層析技術,快速定量檢測出布魯氏菌[29].

2 磁性納米粒子用于細菌檢測

2.1 磁性分離

納米粒子由于具有較高的物理和化學穩定性、生產成本低、易于生物修飾,并且使用磁鐵易于分離和濃縮細菌等優點[30],故在納米醫學領域,磁性納米顆粒的應用已經變得越來越廣泛.Joo小組通過連有單克隆抗體的超順磁性Fe3O4納米粒子從牛奶中分離出沙門氏菌[31].細菌復合物再連接到轉化酶,并分散在蔗糖溶劑中,通過蔗糖水解為葡萄糖與果糖,通過血糖儀來測量葡萄糖的濃度來間接測定沙門氏細菌的濃度,檢測限可達10 cfu/mL.檢測原理如圖3所示.

圖3 Fe3O4納米粒子分離沙門氏菌原理圖[31]

利用磁性納米粒子能夠從復雜的溶液體系中,捕獲和分離微生物細菌,分離出純培養物用于分析實驗.氨基功能化的納米磁珠(AF-MNPs)能夠有效的捕獲與分離細菌,這種AF-MNPs可以快速的從水溶液、食品以及尿液中分離出細菌[32].另外,氨基修飾的Fe2O3納米粒子與連有量子點的不同抗體結合后,形成了類似“三明治”的復合體結構,能夠有效的從食品樣品中分離出多種食源性致病菌細菌,檢測限可達10-3cfu/mL.

使用磁性納米粒子可以富集分離目標菌.Chockalingam研究小組發現經阿拉伯糖修飾的Fe3O4納米粒子可用于分離檢測S.aureus細菌[33],3 min內,檢測限可達8～10 cfu/mL.Jin研究小組使用連接氨基酸的Fe3O4@AA能夠有效的從水中分離出枯草芽孢桿菌、大腸桿菌15597,分離率很高[34].

2.2 基于核磁共振技術的細菌檢測

近幾年,一種以核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)為原理的生物大分子檢測方法受到了廣泛的關注.對于同一體積比的磁納米顆粒而言,水溶液中磁納米顆粒直徑由小變大,對水中質子的T2弛豫時間的影響也由小變大.由于生物材料上具有的抗原決定簇,可以與免疫功能化磁珠的抗體特異性結合,進一步會使免疫功能化磁珠富集在生物大分子上,引起實驗體系中橫向弛豫時間(T2)的變化,NMR可以敏感的檢測到這一變化[35].目前,這一技術路線已經在核酸、蛋白、藻類毒素等的檢測中得到了應用,顯示了極高的靈敏度[36].

Perez等以DNA-DNA、蛋白-蛋白、蛋白-小分子以及酶相互作用為模型,證實了磁性弛豫轉換(magnetic relaxation switches,MRS)能高靈敏度、高特異性的檢測分子間的相互關系,并且在混合體系中(如全細胞融胞產物),這一變化能被直接檢測[37].Colombo等研究表明,采用生物功能化的磁珠,結合橫向弛豫時間的變化(ΔT2),可以在飛摩爾水平特異性的檢測人血清白蛋白(anti-HSA).Kim等采用NMR方法開展的對人絨毛膜促性腺激素(hCG)的檢測研究表明[38],最低檢測限達到3.57 nmol/L.Wei ma等的研究表明,采用基于低場磁共振方法的免疫傳感器,可以在一個反應中高靈敏度的檢測湖水中的環形七肽微囊藻毒素[39],檢測限達到0.6 ng/g,檢測范圍為1～18 ng/g.在對微生物樣本的檢測中,Koh等采用NMR免疫傳感器對流感病毒抗體的檢測表明,檢測靈敏度可以達到1.4×10-7mol.Perez等采用NMR方法對單純性皰疹病毒(HSV)與腺病毒(ADV)檢測研究表明,最低可以在10μL體系中檢測到5個病毒粒子[37].Kaittanis等構建了NMR免疫探針,對血液與牛奶中的鳥分枝桿結核菌(MAP)進行檢測研究,最低檢測限達到15.5 cfu/mL.Kaittanis等采用葡聚糖包被的NMR探針,對血液中的金黃色葡萄球菌進行藥敏評價,研究了在復雜、不透明體系中NMR免疫探針檢測方法的可行性[40].Zhao等構建了連接阪崎腸桿菌抗體的NMR傳感器,檢測中當溶液中細菌數目增多,E.sakazakii 抗原會競爭溶液中有限數目的納米磁珠,導致T2的改變.NMR免疫探針核磁共振檢測方法,不僅能在復雜體系中高靈敏度、特異性的檢測目標生物分子,而且具有目標濃度越低,ΔT2值越高的特點[41].

3 展 望

傳統的食源性細菌檢測耗費時間較長,檢測靈敏度較低,而基于納米粒子的檢測技術為有效快速檢測致病菌提供了技術支持;生物傳感器逐漸成為成本合理的便攜式設備,具有高靈敏度、使用方便等優點,但挑戰依然存在,超靈敏度細菌檢測依然存在挑戰;依據納米粒子的生物傳感器為同時檢測多種細菌提供了良好的依據;納米粒子提供了信號放大的作用,同時具有光學及電學特性,使部分細菌的超靈敏度檢測成為可能,將納米粒子檢測應用于更多微生物致病菌的研究需要研究者不斷地探索;使用不同尺寸的量子點可以同時檢測大腸桿菌和鼠傷寒桿菌.盡管量子點用于檢測食品、農業、環境樣品中病原體可行性很高,但如何生產出大規模具有生物相容性并且薄的量子點仍然是一個挑戰.

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