納米金比色法在酶活力測定中的應用進展

趙靈芝，張小清，苗延青，鄧文婷，胡 顥

（西安醫學院藥學院，陜西西安710021）

酶是與人體所有生命活動相關的系列生化反應的高效催化劑。酶活力受多種因素的調控，與有害毒素、酶激活劑或酶抑制劑的篩選以及相關的病理學研究密切相關，因此酶可應用于靶向性治療方法的開發［1－2］。目前常用的酶活力測定方法主要有分光光度法、熒光法、同位素法等，存在檢測靈敏度低、易產生非特異性干擾等問題。近年來，納米金因具有局域表面等離子共振效應的光學特征和良好的生物相容性，已被廣泛應用于生理活性物質的分析中，包括DNA、氨基酸、蛋白質、金屬離子等［3－6］。Mirkin等［7］基于納米金溶液在聚集和解聚集過程中的顏色變化，以納米金為探針，開拓性地完成了肉眼可視化分析寡聚核苷酸的可視化檢測方法。研究者基于納米金所呈現的顏色與其粒子尺寸或其聚集狀態之間的依賴關系發展了多種以納米金為探針的比色測定法，其中納米金比色法在酶活力測定中的應用進展較快［8－25］。

作者在此綜述了納米金比色法的應用原理及其在酶活力測定、酶抑制劑篩選等方面的研究進展，并對今后的研究趨勢進行了展望。

1 納米金比色法的應用原理

納米金顆粒呈現的顏色與金顆粒的尺寸、間距、表面電荷和介質鹽濃度密切相關?；诿复呋孜锇l生生化反應前后所引起納米金聚集狀態的變化，納米金比色法用于酶活力測定的原理大致有兩種［8］：一是通過酶的加入或酶催化反應引入連接劑，使納米金從分散狀態轉變為聚集狀態（圖1a）；二是改變納米金表面電荷或酶切納米金表面的連接劑，使納米金從聚集狀態轉變為分散狀態（圖1b）。

圖1 納米金比色法酶活力檢測原理示意圖［8］Fig.1 Principles of gold nanoparticles in colorimetric detection of enzyme activity［8］

按引起納米金聚集方式的不同，比色法測定酶活力可分為交聯作用引起的聚集變化和非交聯作用引起的聚集變化。用于比色法檢測的裸納米金，一般是表面修飾檸檬酸的納米金顆粒，在一定的鹽濃度下，溶液中異種電荷的離子中和納米金顆粒表面的電荷，使相鄰納米金顆粒的間距縮小，發生不可逆聚集，進而促使納米金的顏色由酒紅色向藍紫色轉變。如對納米金表面進行功能化修飾，可改變其表面電荷，從而改變納米金在特定鹽溶液中的聚集狀態，這是基于非交聯作用（non－crosslinking aggregation）的鹽效應的納米金比色法。而在納米金表面修飾特異性識別分子［如：生物素（biotin）］，當靶物質親和素（avidin）加入時即可識別，從而促使納米金聚集，這是基于交聯作用（crosslinking aggregation）的納米金比色法。

2 納米金比色法在酶活力測定中的應用

2.1 基于交聯作用的納米金比色法

基于交聯作用的納米金比色法一般使用功能化的納米金作探針，將分子識別元件連接在納米金表面，通過酶的加入或酶催化反應引入連接劑，從而使納米金從分散狀態轉變為聚集狀態。

Wang等［9］發展了cAMP依賴型蛋白激酶A（the cAMP－dependent protein kinase A，PKA）和鈣調素依賴型蛋白激酶Ⅱ（the calmodulin－dependent kinaseⅡ，CaM KⅡ）2種酶活力測定和3種抑制劑篩選的方法，檢測原理（圖2）是基于酶催化底物磷酸化，將生物素嫁接到納米金表面，以表面修飾生物素的納米金作為探針1、修飾親和素的納米金作為探針2，通過生物素與親和素的特異性識別，納米金粒子發生交聯聚集而呈現藍色。當酶抑制劑存在時，生物素就不能嫁接至納米金表面從而造成交聯作用無法發生，納米金最終呈現分散狀態。

圖2 cAMP依賴型蛋白激酶A和鈣調素依賴型蛋白激酶Ⅱ的酶活力測定和抑制劑篩選原理示意圖［9］Fig.2 Schematic representation of phosphorylation／biotinylation of substrate nanoparticles followed by addition of avidin－gold nanoparticles in the presence and absence of a kinase inhibitor［9］

通過酶將識別分子修飾至納米金表面，進一步通過特異性抗原與抗體識別促使納米金交聯的方法也見于組蛋白甲基轉移酶和組蛋白乙酰轉移酶活力測定和相關抑制劑篩選中［12］。這些研究基于酶抑制劑破壞交聯作用使納米金聚集狀態改變來反映酶抑制劑抑制能力強弱，并且僅靠肉眼觀察即可進行判斷，有望發展并應用于可視化高通量藥物篩選研究中。

此外，還有基于DNA互補鏈識別、抗原抗體識別、肽鏈交聯的納米金探針。當某種酶加入后，其選擇性切斷連接鏈活性位點，從而使聚集的納米金顆粒重新分散呈現酒紅色。

Guarise等［10］基于交聯作用發展了蛋白酶（protease）活力檢測方法：首先設計交聯劑多肽鏈的結構，以含有硫醇基的半胱氨酸為多肽鏈的頭尾，將其作為蛋白酶的多肽底物，在無酶狀態下，多肽鏈頭尾的雙巰基可將分散態的納米金連接起來，使納米金發生交聯作用而聚集；當蛋白酶存在時，由于它對多肽鏈選擇性切割，造成多肽鏈僅存1個巰基，交聯作用被破壞，導致納米金呈現分散的狀態。此方法是基于蛋白酶催化肽水解前后交聯作用被破壞導致納米金聚集狀態的改變來實現的。Xu等［11］基于相似的原理發展了DNA內切酶活力檢測和酶抑制劑篩選方法。

基于交聯作用的比色法用于其它酶活力測定和相關抑制劑的篩選也被多次報道［12－15］，但有一些局限性：其一，受交聯劑結構的限制，需要其頭尾兩端均具有可與納米金表面結合的官能團（如巰基），為了得到這種特殊結構的官能團需要經過繁瑣的分子設計、修飾和合成過程，使方法變得復雜；其二，在功能化納米金探針準備過程中，需要將多余的配體分子與納米金探針進一步分離；其三，交聯過程是緩慢的動態過程，這使原本快捷的比色法失去優勢。

2.2 基于非交聯作用的納米金比色法

為了克服交聯作用的局限，研究者發展了多種基于非交聯作用的納米金比色法，如通過交聯劑調節顆粒間距而改變納米金顏色，或通過設計納米金表面電荷來調節納米金的聚集狀態。在酶加入前，對納米金顆粒表面進行分子設計使其帶有一定電荷而呈現某種聚集狀態；當加入酶后，酶催化反應改變納米金表面電荷，使納米金聚集狀態發生改變而變色。Choi等［16］通過設計納米金表面的電荷（圖3），發展了可視化檢測堿性磷酸酯酶活力和酶抑制劑篩選的方法：首先設計酶的底物結構，以半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸三肽為底物。這樣設計的目的在于：利用半胱氨酸上的巰基可將三肽修飾于納米金表面上，天冬氨酸上的胍基與納米金之間的靜電作用以及電子給體與受體的作用可將分散的納米金交聯在一起而發生聚集，酪氨酸上的磷酸基所帶的負電荷可阻礙相鄰帶正電荷的胍基與納米金結合而破壞胍基誘導的納米金聚集。當堿性磷酸酯酶加入到體系中時，由于酶催化作用使磷酸根離子脫離多肽鏈從而使磷酸基的阻礙作用消失，導致納米金聚集。此研究通過設計底物結構和納米金表面電荷來達到酶活力檢測和抑制劑篩選的目的，為酶活力檢測研究提供了新的思路。

基于設計納米金表面電荷的比色法也被應用于糖苷酶、腺苷、高半胱氨酸水解酶、蛋白激酶、透明質酸酶、端粒酶等活性的測定［17－21］。

圖3 基于設計納米金表面電荷的堿性磷酸酯酶活力檢測原理示意圖［16］Fig.3 Alkaline phosphatase（ALP）assay based on color change during peptide－induced Au－NP aggregation［16］

2.3 以裸納米金為探針的比色法

不論納米金比色法基于交聯作用還是基于設計納米金表面電荷，以金硫鍵（Au－S）將抗原、DNA、多肽等小分子連接在納米金表面，均需要對納米金表面進行設計和修飾。近年來，以裸納米金為探針的比色法被多次報道［22－25］。其原理也是基于納米金所呈現的顏色與其粒子尺寸或其聚集狀態之間的依賴關系。與交聯作用不同的是，此法利用直接化學還原得到不需要進一步功能化的納米金膠體作為檢測探針。

Zhao等［22］發展了一種以裸納米金為探針分子的可視化檢測牛腸堿性磷酸酶活性的方法。其檢測原理是：酶的底物ATP、ADP、AMP、腺苷等均可通過堿基上的氨基與納米金發生電子給體與受體作用而快速連接在納米金表面置換其表面原有的檸檬酸分子，ATP、ADP、AMP的磷酸骨架均帶有負電荷，可增強納米金的抗鹽能力，但是由于所保護的納米金表面所帶電荷不同，使得它們在一定濃度的鹽溶液中具有不同的穩定性，在酶催化ATP轉化為腺苷過程中納米金表面電荷發生變化，從而改變納米金的聚集狀態，達到酶活力檢測的目的。

Shen等［23］基于相似的原理發展了可視化檢測核酸酶活性的方法。該法也是以裸納米金為探針分子，是根據不同鏈長的單鏈DNA保護的納米金表面所帶負電荷不同，使納米金探針在一定濃度鹽溶液中具有不同聚集狀態而發展起來的。

通過選擇納米金表面的保護劑、設計納米金表面電荷，可以發展更多可視化檢測方法用于檢測可引起納米金表面電荷和抗鹽能力變化的靶物質。但以裸納米金為探針發展的比色法也存在一些局限性，如：裸納米金顆粒對所存在的介質非常敏感，當待測生物樣品成分復雜、鹽濃度較高或含有大分子（如蛋白質）時，可使裸納米金發生聚沉。針對這些問題，研究者將芯片技術與基于裸納米金的比色法結合起來用于生物樣品的現場分析。一方面，一體化的分析芯片可提供生物樣品的前處理來減少復雜成分對裸納米金探針比色法的干擾；另一方面，芯片具有高通量優勢，可用于對酶抑制劑和分子庫大批量、快速的篩選。

3 展望

酶活力測定與體內生理活動、病理學以及開發靶向性治療方法研究密切相關。納米金顆粒表面等離子共振效應所產生的特征光吸收、表面易于修飾、易合成等特征，使其作為極好的分析平臺被應用于酶活力測定和酶抑制劑分子篩選研究工作中。近年來，研究者利用不同的分子識別配體構建了多種納米金探針，納米金比色法因具有高靈敏度和選擇性已成為酶活力測定的主要手段。但是，此法仍需要進一步改進，如通過輔助其它技術手段（如熒光技術、拉曼散射技術等）來提高方法的穩定性、準確性、重現性和選擇性，并結合微流控芯片技術使其發展為高通量、一體化的分析平臺等。另一方面，已有報道均是基于球形納米金粒子發展的分析方法，其它形狀獨特的三角形或六邊形金顆粒、納米棒等的光學性能仍未得到開發利用，不同尺寸、不同形狀的納米金顆粒所具有的多光子發光、等離子共振能量轉移以及催化等優異性能有待于進一步開發，并應用于酶活力測定和生物醫學分析和診斷中。

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