漆酶及未培養微生物中漆酶基因的研究進展

齊 晶，周 賡，盧向陽，田 云

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙410128；2.湖南省農業生物工程研究所，湖南長沙410128）

漆酶（對苯二酚氧化酶，EC 1.10.3.2）是一類含銅的多酚氧化酶，屬于藍色多銅氧化酶家族，能利用分子氧作為電子傳遞介質氧化多種類型的酚類化合物及非酚類化合物，將分子氧還原為水［1－2］，是一種糖蛋白。漆酶因其底物范圍很寬而被廣泛應用于紙漿漂白［3］、染料脫色［4］、有機物合成［5］、木質素降解［6］等工業及生物技術領域。由于不同應用領域要求不同酶學性質的漆酶，因此通過開發新的漆酶基因資源來獲得具有多樣性的漆酶意義重大。在自然界中存在著大量無法用傳統方法培養的微生物，科研工作者通過構建宏基因組文庫，從中篩選漆酶基因，為漆酶的多樣性、高效性篩選提供了新的途徑。

1 漆酶的作用特點及研究現狀

1.1 漆酶的催化氧化特性

漆酶含有4個銅離子，分別存在于3個不同的結合位點上，在漆酶的催化機制中起著關鍵性作用［7］。漆酶能夠利用氧氣作為電子受體，氧化多種酚類及芳香族化合物［8］。大部分漆酶以胞外單分子球蛋白的形式存在，分子質量在40～110kDa之間，漆酶分子都存在著不同程度的糖基化［9］。

漆酶的催化氧化作用主要由漆酶的4個銅離子和底物的自由基共同完成。漆酶分子結構中的4個銅離子構成了2個活性中心：T1銅離子結合位點，這個位點與漆酶底物的氧化能力相關聯；T2和2個T3銅離子組成三銅離子還原中心結合位點，該位點不僅能接收來自T1位點的電子，還能將氧氣還原成水。底物與酶活性中心的T1銅離子位點相結合，底物氧化釋放電子，三銅離子還原中心通過His－Cys－His途徑轉化電子，接著將電子傳遞給氧分子，將氧分子還原成水［10］。與此同時，漆酶底物形成自由基，底物的自由基自身可以結合也可以相互偶聯，從而生成聚合物或偶聯產物［11］。漆酶屬于單電子氧化還原酶類，在小分子介質存在下，漆酶還能夠氧化非酶底物［12］。據初步統計，漆酶的催化底物已達200多種［13］，根據其結構的特異性分為6類：（1）酚類及其衍生物：鄰、對苯二酚等；（2）芳胺類及其衍生物：氨基苯、1，5－萘二胺；（3）羧酸及其衍生物：原兒茶酸、香豆酸、對氨基水楊酸；（4）甾體激素和生物色素：雌甾二醇、氧化膽紅素；（5）金屬有機化合物：二茂鐵類化合物；（6）其它非酚類化合物：亞鐵氰化鉀、抗壞血酸。

1.2 漆酶的研究現狀

漆酶作為一種生物酶，具有酶的所有特點，溫度、底物、pH值對漆酶的影響非常大。漆酶在生產和應用過程中都有可能失活，影響酶的使用效果。漆酶按來源可以分為植物漆酶、真菌漆酶、細菌漆酶以及動物漆酶等4大類［8］。表1列出了這4類酶的優缺點［8，14－15］。

在這4類漆酶中，以真菌漆酶研究得最為深入。真菌漆酶的研究主要包括以下4方面：（1）對不同產漆酶真菌進行菌種篩選、基因克隆，篩選出高效、產酶量大的菌種，其中白腐真菌產生的漆酶被認為是效果最好的［16］，但真菌漆酶的一些缺點（如熱穩定性差、不能用于原核表達系統高效表達等）也限制了其應用范圍；（2）對產漆酶真菌菌種進行改造，包括利用物理、化學、生物等方法使菌株發生改變，提高漆酶產量，以及對真菌漆酶的分子結構和空間結構的研究；（3）對產漆酶真菌的發酵條件進行優化，使漆酶產量最大化；（4）真菌漆酶在降解木質素方面的理論研究，以及在造紙、紡織工業等領域的應用。

表1 4類漆酶的優缺點Tab.1 The advantages and disadvantages of the four kinds of laccases

漆酶的催化底物較多，因此具有廣闊的應用前景，但天然來源的4類漆酶存在產量低、性質單一、價格昂貴、活性不穩定等不足，難以滿足實際需求，漆酶的工業化生產也受到影響。

2 未培養微生物中漆酶基因的研究進展

2.1 未培養微生物及研究手段

未培養微生物（uncultured microorganisms）是指到目前為止人們還無法純培養的微生物［17］。環境中絕大部分的微生物還沒有被人類所認識，其中勢必蘊含著巨大的生物資源。無論是未培養微生物的種群結構，還是其功能的特異性、新陳代謝途徑等都與純培養微生物有著不一樣的特點，這其中隱藏著大量未知的生物遺傳信息［18］。所以開發和利用未培養微生物，并從特定的環境中篩選出某些未知的微生物、克隆獲得具有特異性功能的基因是目前微生物資源的研究熱點。

因為自然環境中大部分的微生物不能依靠傳統的培養方法進行篩選，造成了微生物資源的浪費和丟失，為此科研工作者研發了一種新的方法——宏基因組學（metagenomics）［19］對未培養微生物進行研究。宏基因組的定義為：環境中全部微生物的遺傳物質的總和，包括可培養的微生物基因和不可培養的微生物基因。宏基因組技術是：提取特定環境中的總DNA分子，克隆到大腸桿菌等宿主細胞中用來構建宏基因組文庫［20］，然后再對宏基因組文庫中的克隆子進行功能驅動篩選和序列驅動篩選分析。目前，已經通過構建宏基因組文庫篩選得到大量新的基因，如編碼纖維素酶［21］、蛋白酶［22］、酯酶［23］、木聚糖酶［24］等活性物質的基因。

2.2 未培養微生物中漆酶基因的研究進展

隨著分子生物學和基因組學等技術的發展，漆酶的工業化生產逐漸朝著分子層面進行，如漆酶的異源表達系統的構建。漆酶異源表達是將獲得的漆酶基因插入適合的載體中進行高效表達的分子技術。完成漆酶異源表達的前提是必須得到漆酶基因。在漆酶基因的克隆和鑒定方面，現階段國內外采用的主要方法是：首先從以木質纖維素為食物的昆蟲［25－26］或利用木質纖維素轉化為自身生長需要的菌類［27］等具有木質素降解能力的環境中分離具有漆酶活性的微生物，接著對獲得的菌株進行鑒定，利用分子生物學的方法對漆酶基因進行克隆、鑒定和表達，研究菌株的產漆酶條件和漆酶的酶學特性。

目前，科研工作者從未培養微生物中篩選克隆新的漆酶基因［28］，并將新的漆酶基因構建至表達載體，對其表達產物進行酶學性質分析，豐富了漆酶性質的多樣性。Beloqui等［26］從牛瘤胃中構建宏基因組文庫篩選得到RF51基因，生物信息學軟件分析預測這些序列屬于擬桿菌屬，將其在大腸桿菌中進行表達，對得到的漆酶進行了酶學性質、銅離子結合位點等的分析；Coy等［29］從白蟻后腸中篩選得到RfLacA、RfLacB基因，通過對其編碼的蛋白研究發現，白蟻后腸的漆酶來源于白蟻，在唾液腺產生，分泌到前腸，結合銅離子后，在白蟻腸道中對木質纖維素的降解起作用；Ye等［30］從紅樹林環境中構建宏基因組文庫，篩選獲得一段大小為1 500bp的具有堿性漆酶活性的基因，命名為Lac591，Lac591基因與嗜堿芽孢桿菌的漆酶相比同源性為52%，且有4個作為銅離子結合位點的組氨酸保守區域；Fang等［31－32］從中國南海的海洋微生物中通過構建宏基因組文庫篩選獲得1個在弱堿性條件下有獨立活性且對氯化物有極強耐受性的新漆酶基因片段，命名為Lac15，Lac15有439個氨基酸，大小為1 320bp，含有3個保守的Cu2＋結合區域；Fang等［33］從熊貓糞便中構建宏基因組文庫篩選得到Lac51基因，該基因編碼的漆酶不僅是金屬離子的氧化酶，而且很有可能是在宿主細胞胞外起作用的胞外酶，因為Lac51基因的N端有一個TAT型的信號肽。

在牛瘤胃、白蟻后腸、紅樹林土壤、南海海水、熊貓糞便等未培養微生物中克隆得到漆酶基因的具體研究 情況見表2。

表2 未培養微生物中漆酶基因的研究情況Tab.2 Research status on laccase genes from uncultured microorganisms

以上研究成果說明，通過構建未培養微生物宏基因組文庫能克隆到新的高效漆酶基因，未培養微生物是一個巨大的資源庫，不僅數量多，而且種類豐富，為漆酶基因篩選的多樣性、高效性提供了重要的物質基礎。

3 展望

宏基因組技術避開了需要培養的步驟，彌補了傳統純培養微生物技術的不足，為人們調查微生物的群落及其資源、開發利用未培養微生物的多樣性、發現新的基因提供了很好的策略［34］。宏基因組技術是一種高效快速獲得漆酶基因的方法，豐富了漆酶的來源，拓寬了木質素酶的研究領域，加強了未培養微生物中漆酶的基礎和應用研究，在生物質資源研究和綜合利用等方面具有重要的意義。

在篩選新型的工業用酶和生物活性物質方面，宏基因組技術具有高效、快速等優勢，在未培養微生物的尋找、功能基因篩選、生態學研究等領域有著巨大的應用潛能。

由于漆酶功能的特殊性，今后應進一步加強和完善以下兩方面工作：（1）目前對宏基因組文庫進行篩選多采用底物丁香醛連氮及愈創木酚，但這兩種底物對漆酶反應的效果不是很明顯［32］，因此，選擇更合適的篩選底物能夠大大提高篩選效率；（2）加強漆酶性質與功能方面的研究：造紙工業，主要是利用漆酶對纖維素進行降解，降解機理以及詳細的降解過程還有待進一步研究［35］；紡織工業，排放的廢水大部分都是高溫且呈堿性的，要利用漆酶降解廢水中的染料［36］，必須加強漆酶的性質以及漆酶的固定化等方面的研究。

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