拳參黃酮與VC、蘆丁協同抗氧化作用研究

劉軍軍，劉金蘭，李 帥，安紅鋼，吳冬青

（河西學院化學化工學院甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅張掖734000）

拳參（Polygonum bistorta L.）別名紫參、倒根草、地蝦，為蓼科屬（Polygonaceae）植物拳參的根莖，其味苦澀，性微寒，具有清熱解毒、止瀉、鎮驚息風、消腫止血之功效，用于赤痢、熱瀉、肺熱咳嗽、癰腫、瘰疬、口舌生瘡、吐血、痔瘡出血、毒蛇咬傷等病癥［1］，主要分布于河南、吉林、山東、遼寧、四川、甘肅等地。近年有文獻報道從拳參中分離得到沒食子酸、樹膠、樹脂、酚酸等活性成分，并對拳參黃酮進行了純化和抗氧化性研究［2－5］。

不同藥物復配后可產生相加性、協同性或拮抗性等相互作用。目前研究復配效應的方法有等輻射分析法、分數分析法、概率分析法和響應曲面分析法等［6］。其中等輻射分析法是近年來國內外常用于判斷藥物之間相互作用的方法，能夠簡便、精確地對藥物之間的相互作用進行定性、定量分析［7－8］。有研究表明，復合抗氧化劑的抗氧化活性高于單個組分在添加濃度下的活性之和，即表明組分之間存在協同抗氧化作用［9］，可使產品更高效、更經濟、更具安全性，且抗氧化性能得到改善［10］。作者在此采用Isobologram分析和清除·DPPH法相結合的方法對拳參黃酮與VC、蘆丁的協同抗氧化作用進行了考察，以期為拳參的進一步開發利用提供科學依據。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

拳參，2013年采自甘肅隴西。

蘆丁（生化試劑，批號F20040304），醫藥集團上海化學試劑公司；·DPPH（生化試劑，批號1898－66－4），梯希愛化成工業發展有限公司；抗壞血酸（VC）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等均為分析純。

WFJ－2100型可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；RE－2000A型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；HH－4型數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；KQ3200DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拳參黃酮溶液的制備

取拳參干燥藥材粉碎，過50目篩，以料液比1∶10（g∶mL）加入60%乙醇，在40℃下超聲提取1h，抽濾，濾液濃縮，轉入100mL容量瓶中用60%乙醇定容，冷藏備用。

1.2.2 拳參黃酮質量濃度的測定［11］

1）標準曲線的繪制：準確稱取已烘干至恒質量的蘆丁0.0235g，用60%乙醇溶解并定容至100mL，得0.2350mg·mL－1的蘆丁標準溶液。準確移取1.00 mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL蘆丁標準溶液于25mL容量瓶中，分別加入5% NaNO2溶液1.00mL，搖勻，靜置6min；加入10% Al（NO3）3溶液1.00mL，搖勻，靜置6min；加入5% NaOH溶液10.00mL，用60%乙醇定容，搖勻，靜置15min后，在500nm波長處測定吸光度，以蘆丁濃度（c）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，擬合得到回歸方程：A＝11.079c－0.029，R2＝0.9999，線性范圍為0.0094～0.0564mg·mL－1。

2）移取0.10mL拳參黃酮溶液于25mL容量瓶中，按照上述方法測定吸光度，根據回歸方程計算拳參黃酮質量濃度。

1.2.3 拳參黃酮清除·DPPH能力測定［12］

移取不同濃度的拳參黃酮溶液1.00mL，用50%乙醇補加至4.00mL，再加0.1mg·mL－1的·DPPH溶液1.00mL，搖勻，靜置，室溫避光反應30min，然后于517nm波長處測定吸光度A1；空白組以等體積無水乙醇代替·DPPH溶液，測定吸光度A2；對照組以等體積50%乙醇代替樣品溶液，測定吸光度A0；以VC、蘆丁為陽性對照組。按式（1）計算拳參黃酮對·DPPH的清除率：

1.2.4 Isobologram分析法研究拳參黃酮與VC、蘆丁的相互作用［13］

根據VC、蘆丁、拳參黃酮單獨作用時的IC50值，選擇拳參黃酮與VC、蘆丁的比例（質量濃度比，下同），將拳參黃酮與VC或蘆丁按上述比例混合后，按1.2.3方法測定復合抗氧化劑對·DPPH的清除能力，計算清除率和IC50mix值。

1.2.5 統計學分析［13］

對藥物之間相互作用關系進行統計學分析。按式（2）計算IC50add：

式中：IC50add、IC50a分別為理論復配組、a藥單獨作用時的IC50值；Pa、Pb分別為a、b在復配組中所占的比例；R為a、b兩種抗氧化劑單獨使用時的效價比，即R＝IC50a／IC50b。

由實驗得到復配組實際的IC50mix值，對IC50add和IC50mix進行顯著性比較：如果IC50add顯著小于IC50mix，表明藥物之間具有拮抗作用；如果IC50add顯著大于IC50mix，表明藥物之間具有協同作用；如果IC50add與IC50mix無顯著差異，表明兩者具有相加作用。無論是協同作用還是相加作用，兩者都可以有效指導人們在用藥時減少藥物的浪費，充分利用各自優點取長補短。

進一步按式（3）計算相互作用指數（γ），以評價協同、相加或拮抗作用的程度：若γ＝1，表示兩者之間為相加作用；γ＞1，表示拮抗作用，且γ值越大拮抗作用越強；γ＜1，表示協同作用，且γ值越小協同作用越強（置信度P＝0.95）。

2 結果與討論

2.1 拳參黃酮的質量濃度

進行5組平行實驗，測得提取溶液中拳參黃酮質量濃度為4.095mg·mL－1，RSD為1.364%。

2.2 拳參黃酮對·DPPH的清除能力

·DPPH是一種人工合成的單電子、以氮為中心的化合物，向其中加入抗氧化成分時，·DPPH接受1個電子，溶液紫色變淺，且褪色程度與抗氧化劑質量濃度呈線性關系［14－15］。測定拳參黃酮、VC、蘆丁對·DPPH的清除能力，結果見圖1和表1。

圖1 拳參黃酮、VC和蘆丁清除·DPPH能力Fig.1 The ability of scavenging·DPPH of flavonoids fromPolygonum bistorta L.，VC and rutin

表1 拳參黃酮、VC、蘆丁清除·DPPH的IC50值Tab.1 IC50Values of scavenging·DPPH of flavonoids fromPolygonum bistorta L.，VC and rutin

由圖1可知，隨著樣品質量濃度的增大，三種溶液對·DPPH的清除率均呈上升趨勢，在實驗范圍內，拳參黃酮對·DPPH的清除作用強于蘆丁、弱于VC。

由表1可知，清除·DPPH能力大小依次為：VC＞拳參黃酮＞蘆丁，說明拳參黃酮具有較強的抗氧化能力。

2.3 Isobologram分析法評價拳參黃酮與VC、蘆丁協同抗氧化能力

2.3.1 拳參黃酮與VC、蘆丁復配清除·DPPH能力

基于拳參黃酮與VC、蘆丁的IC50比值分別為1∶1.54、1∶0.77，選擇拳參黃酮與VC或蘆丁的比例為3∶1、1∶1、1∶3，每組的質量濃度范圍為0.005000～0.035000mg·mL－1。按照上述比例混合后，按1.2.3方法測定復合抗氧化劑對·DPPH的清除率并計算其IC50mix，結果見表2和表3。

表2 拳參黃酮與VC、蘆丁復配清除·DPPH的能力Tab.2 The ability of scavenging·DPPH of flavonoids fromPolygonum bistorta L.combined with VC or rutin

由表2可知，隨著復合抗氧化劑濃度的增大，清除·DPPH的能力逐漸增強，復合抗氧化劑達到一定濃度后清除率基本保持不變。

由表3可知，拳參黃酮分別與VC、蘆丁復配后的IC50mix值大小均為3∶1＜1∶1＜1∶3，表明拳參黃酮與VC、蘆丁的質量濃度比為3∶1時復配抗氧化效果最佳。

2.3.2 拳參黃酮與VC、蘆丁復配后的Isobologram分析

表3 拳參黃酮與VC、蘆丁復配清除·DPPH的IC50mix值和γ值Tab.3 IC50mixandγValues of flavonoids fromPolygonum bistorta L.combined with VC or rutin against·DPPH

將實驗所得VC、蘆丁的IC50值及95%可信線標繪于橫坐標，拳參黃酮的IC50值及95%可信線標繪于縱坐標，將IC50值連接成相加線，繪制95%置信區，并繪入復配體系的IC50值，結果見圖2。若復配體系的效應點落在相加線及95%置信區內，表示兩藥為相加作用；若落在相加線左側，表示兩藥為協同作用；若落在右側，則表示兩藥為拮抗作用。

由圖2可知，拳參黃酮與VC、蘆丁復配后的效應點均在相加線及置信區左側，說明兩藥之間均存在協同抗氧化作用。

2.3.3 統計學分析

拳參黃酮與VC、蘆丁復配體系的IC50add值、IC50mix值和相互作用指數γ見表3。

由表3可知，兩組復配體系的IC50mix都顯著小于IC50add，兩者之間存在著差異，γ值都小于1，進一步說明拳參黃酮與VC、蘆丁以不同比例復配之后，其抗氧化能力均比它們單獨作用時強，相互間存在良好的協同抗氧化作用，尤其是拳參黃酮與VC、蘆丁質量濃度比為3∶1時，協同抗氧化作用最好。由于拳參黃酮與VC復配體系的IC50mix均小于拳參黃酮與蘆丁復配體系的IC50mix，因此，拳參黃酮與VC復配體系的協同抗氧化作用強于拳參黃酮與蘆丁復配體系。

3 結論

拳參黃酮與VC、蘆丁以不同比例復配后有明顯的協同抗氧化作用，比任一單獨使用效果更好。當拳參黃酮與VC、蘆丁的質量濃度比為3∶1時，協同抗氧化能力最強，且拳參黃酮與VC的協同抗氧化作用要強于拳參黃酮與蘆丁的協同抗氧化作用。

圖2 拳參黃酮與VC（a）、蘆丁（b）復配后的Isobologram分析圖Fig.2 Isobolographic plot of flavonoids fromPolygonum bistorta L.combined with VC（a）or rutin（b）

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