類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清骨形態(tài)發(fā)生蛋白7的水平及臨床意義

方芳，袁紅霞，丁爽，段宏梅，吳春玲，劉海娜，肖衛(wèi)國

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，沈陽110001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，遼寧錦州121001）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清骨形態(tài)發(fā)生蛋白7的水平及臨床意義

方芳1，袁紅霞2，丁爽1，段宏梅1，吳春玲1，劉海娜1，肖衛(wèi)國1

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，沈陽110001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，遼寧錦州121001）

目的探討類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者血清中骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）7的水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系及臨床意義。方法采用酶聯(lián)免疫吸附法測定46例RA患者、22例骨關(guān)節(jié)炎（OA）患者、20名健康志愿者血清BMP-7的濃度及血清基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-3的水平，并檢測RA患者血沉（ESR）、類風(fēng)濕因子（RF）等臨床指標(biāo)，計算DAS28評分，比較RA、OA、健康對照組之間BMP-7、MMP-3的差異，并分析BMP-7與MMP-3及其他臨床指標(biāo)的關(guān)系；同時比較RA患者高疾病活動組與非高疾病活動組間BMP-7、MMP-3的差異。結(jié)果RA患者血清BMP-7平均2 440（1 445～3 808）pg/mL，高于OA患者及健康對照者［（1 560±1 462）pg/mL，（1 508±1 176）pg/mL］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.05）；RA患者血清MMP-3水平［（67.02±22.60）ng/mL］高于OA患者及健康對照者［（46.50±21.72）ng/mL，（23.70±17.61）ng/mL］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.05）。RA患者高疾病活動組血清BMP-7水平與非高疾病活動組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），MMP-3水平高于非高疾病活動組（P＜0.05）。RA患者血清BMP-7與血清MMP-3、ESR、CRP、白細(xì)胞、纖維蛋白原水平呈正相關(guān)（r=0.307 3，P=0.037 8；r=0.332，P=0.024 3；r=0.461 8，P=0.001 2；r=0.333 5，P=0.023 5；r=0.360 1，P=0.015 1），與血清白蛋白、免疫球蛋白IgA負(fù)相關(guān)（r=-0.336 5，P=0.022 2；r=-0.292 3，P= 0.048 7），與病程、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、VAS評分、血紅蛋白、血小板、血鈣離子、免疫球蛋白IgG、免疫球蛋白IgM、補體C3、補體C4不相關(guān)。結(jié)論BMP-7可能與RA關(guān)節(jié)炎癥過程有關(guān)，血清BMP-7水平有可能作為評價RA疾病活動的指標(biāo)。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；骨形態(tài)發(fā)生蛋白7；基質(zhì)金屬蛋白酶

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種主要累及關(guān)節(jié)的慢性炎性自身免疫性疾病?；ぱ资荝A關(guān)節(jié)病變的基本病理改變。隨著病程進(jìn)展，滑膜組織增厚伴有新的血管生成，形成血管翳，除了合成正常細(xì)胞外基質(zhì)成分，同時還合成大量基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物、前列腺素和細(xì)胞因子，對關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨及周圍的軟組織結(jié)構(gòu)造成侵蝕和損壞，從而影響關(guān)節(jié)的功能，最終可致殘。在關(guān)節(jié)軟骨和骨受侵蝕和損壞的過程中，由滑膜細(xì)胞和血管翳產(chǎn)生的生長因子和細(xì)胞因子起重要的調(diào)控作用。這些細(xì)胞因子本身即是產(chǎn)生細(xì)胞因子強力的刺激因子，在互相作用、互相調(diào)節(jié)的過程中形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，在RA滑膜病變中起核心作用。目前認(rèn)為，在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）α是關(guān)鍵的細(xì)胞因子，也已有其拮抗劑上市應(yīng)用，但是其高昂的費用對多數(shù)RA患者來說并不能實現(xiàn)長期用藥，并且其治療僅能達(dá)到病情緩解而不是根治。所以，對RA病因特別是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中細(xì)胞因子作用的研究，有助于揭示RA的發(fā)病機制并為治療提供線索和依據(jù)。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）屬于轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）β超家族［1］，對多種組織的發(fā)育、自穩(wěn)和修復(fù)都具有重要的作用。BMP-7又稱成骨蛋白1（osteogenic protein-1，OP-1），是BMPs家族的重要成員。BMP-7成骨能力較強，在維持關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)完整性和促進(jìn)修護(hù)過程中起重要作用。BMP-7基因和蛋白在構(gòu)成關(guān)節(jié)的結(jié)締組織中均有表達(dá)，包括軟骨、半月板、滑膜、韌帶和肌腱［2］。近年關(guān)于BMP-7在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型及人滑膜細(xì)胞中的研究提示其參與了RA的發(fā)?。?～5］。

本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法測定RA患者、骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）患者及健康對照者血清BMP-7的濃度及血清MMP-3的水平，并收集RA患者血沉（erythrocyte sedimentation rate，，ESR）、類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）等臨床指標(biāo)，計算DAS28（disease activity score in 28 joints）評分，比較RA、OA、健康對照組之間BMP-7、MMP-3的差異，并分析BMP-7與MMP-3及其他臨床指標(biāo)的關(guān)系，同時比較RA患者高疾病活動組與非高疾病活動組間BMP-7、MMP-3的差異，探討RA患者血清BMP-7水平的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例選擇：選擇2013年5月至10月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院治療的RA患者46例，診斷符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會（American College of Rheumatology，ACR）修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)或2010年歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟（the European League Against Rheumatiosm，EULAR）。其中，男5例，女41例，平均年齡57.5歲（22～77歲），平均病程91個月（1.5～360個月）。并選擇同期于門診就診或病房住院的OA患者22例，診斷符合1995年ACR修訂的膝關(guān)節(jié)OA分類標(biāo)準(zhǔn)，其中，男3例，女19例，平均年齡56.8歲（29～76歲），平均病程57個月（5～240個月）。健康對照者選自健康體檢者，其中，男2例，女18例，平均年齡52.5歲（31～74歲）。所有入選病例均除外合并其它風(fēng)濕性疾病、感染、腫瘤、心腦血管疾病等。健康對照者既往均無RA及其他自身免疫性疾病病史。各組間性別、年齡無差異。所有標(biāo)本取樣均征得參與者本人同意并簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑及儀器設(shè)備：BMP-7 ELISA試劑盒及MMP-3 ELISA試劑盒（Cloud-Clone公司，美國），離心機（Sigma公司，德國），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，HH-B11），多功能酶標(biāo)儀（TECAN，infinite M200PRO，奧地利）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集：空腹抽取靜脈血3 mL，置于含血清分離膠的抗凝管中，3 000 r/min離心20 min，取離心后上清于EP管中，做好標(biāo)記，-80℃儲存待用。

1.2.2 臨床資料收集：收集RA患者采血同期血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR），類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF），C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP），抗環(huán)瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）抗體，血白細(xì)胞（white blood cell，WBC），血紅蛋白（hemoglobin，HGB），血小板（platelet，PLT），血鈣離子，血清白蛋白，纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB），免疫球蛋白IgG、IgA、IgM，補體C3、C4，并計數(shù)腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、患者VAS疼痛評分，應(yīng)用DAS28評分器計算疾病活動指數(shù)DAS28評分。

1.2.3 實驗分組：根據(jù)DAS28評分，將RA患者分為高疾病活動組（DAS28＞5.1）及非高疾病活動組（DAS28≤5.1）。

1.2.4 采用雙抗體酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒檢測血清BMP-7、MMP-3水平：按照試劑盒操作說明進(jìn)行操作，血清標(biāo)本稀釋10倍，用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的光密度（OD值）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0及Graphpad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析及作圖，計量資料用或M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清BMP-7與MMP-3水平測定（圖1、2）

RA患者血清BMP-7水平2 440 pg/mL（1 445～3 808 pg/mL），高于OA患者血清及健康對照者［（1 560±1 462）pg/mL，（1 508±1 176）pg/mL）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.05）；RA患者血清MMP-3水平（67.02±22.60）ng/mL，高于OA患者及健康對照者［（46.50±21.72）ng/mL，（23.70±17.61）ng/ mL］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.05）。

圖1 血清BMP-7水平Fig.1 Serum level of BMP-7

圖2 血清MMP-3水平Fig.2 Serum level of MMP-3

2.2 按疾病活動度分組比較（圖3）

RA患者高疾病活動組血清BMP-7水平［（3 542±3 390）pg/mL］高于非高疾病活動組［（2 685±1 671）pg/mL］，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），高疾病活動組MMP-3水平［（68.10±22.53）ng/mL］高于非高疾病活動組［（63.57±23.56）ng/mL］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 RA患者高疾病活動組與非高疾病活動組血清MMP-3水平Fig.3 Serum level of MMP-3 in RA patients of high disease activity group and non high disease activity group

2.3 與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

RA患者血清BMP-7與血清MMP-3、ESR、CRP、WBC、FIB呈正相關(guān)（r=0.307 3，P=0.037 8；r= 0.332，P=0.024 3；r=0.461 8，P=0.001 2；r=0.333 5，P=0.023 5；r=0.360 1，P=0.015 1），與血清白蛋白、免疫球蛋白IgA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.336 5，P=0.022 2；r=-0.292 3，P=0.048 7），與病程、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、VAS評分、DAS28評分、HGB、PLT、血鈣離子、免疫球蛋白IgG、IgM、補體C3、C4不相關(guān)（r未列出，P值均＞0.05）。

3 討論

RA患者體內(nèi)存在促炎和抗炎細(xì)胞因子失衡，已有大量的實驗研究證實TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β等是RA發(fā)病重要的促炎因子。針對TNF-α、IL-6已有生物制劑英夫利息單抗、托珠單抗等上市應(yīng)用，但仍有一部分患者對現(xiàn)有生物制劑治療應(yīng)答較差，治療失敗。因此，對影響RA發(fā)病的其他細(xì)胞因子的研究也一直在進(jìn)行，研究者一直試圖尋找新的抗細(xì)胞因子的RA靶向治療藥物。

1965年Urist［6］發(fā)現(xiàn)一種能夠異位誘導(dǎo)肌細(xì)胞成骨的未知因子，后將其命名為BMPs。其后在體研究同樣顯示BMPs具有異位成骨的功能［7］。BMPs在細(xì)胞內(nèi)以無活性的前體形式存在，其前體形式在分泌到細(xì)胞外后形成二聚體，可以為同聚體，也可為異聚體。分泌到細(xì)胞外的BMPs通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌形式發(fā)揮作用。BMP-7是BMPs的重要成員，除具有較強的成骨能力外，還具有多種生物學(xué)功能［2，8，9］，在胚胎發(fā)育的全程均有重要作用，BMP-7基因表達(dá)異常還可導(dǎo)致腎及眼的發(fā)育異常。在RA中，BMP-7通過Smad通路促進(jìn)關(guān)節(jié)修復(fù)，但其表達(dá)增多可能對關(guān)節(jié)炎癥有促進(jìn)作用。目前關(guān)于BMP-7與RA的研究較少，尚缺乏其參與關(guān)節(jié)炎癥過程的機制研究。

MMPs是一類參與人體生理性基質(zhì)降解的內(nèi)肽酶，除了參與胚胎發(fā)育，組織修復(fù)重塑，也參與一些病理過程，如關(guān)節(jié)炎。所有的MMPs以無活性的酶原形式分泌，多數(shù)分泌型MMPs通過細(xì)胞外的蛋白激酶裂解活化，對纖維連接蛋白，層黏連蛋白，Ⅲ、Ⅳ、Ⅸ和Ⅹ型膠原蛋白、蛋白聚糖等均有降解作用。其中MMP-3屬于基質(zhì)降解酶之一，能夠激活多種MMPs。多項臨床實驗證實血清MMP-3水平能夠反映關(guān)節(jié)滑膜炎和關(guān)節(jié)損傷的水平，可以作為檢測RA關(guān)節(jié)炎的指標(biāo)［10～12］。

本研究發(fā)現(xiàn)RA患者血清BMP-7、MMP-3水平均高于OA患者及健康對照者，在高疾病活動組，BMP-7、MMP-3升高的水平更明顯，且RA患者血清BMP-7水平同血清MMP-3水平及ESR、CRP、FIB等炎性指標(biāo)呈正相關(guān)，提示BMP-7可能參與了RA骨破壞的過程。RA患者中高疾病活動組的血清BMP-7水平更高，既往對OA患者血清BMPs的研究發(fā)現(xiàn)，血清BMP-2、BMP-4較健康對照者升高，而BMP-7則無明顯差異［13］，本研究亦未發(fā)現(xiàn)OA患者血清BMP-7與健康對照者之間的存在差異，與既往研究結(jié)果一致。本研究在進(jìn)行相關(guān)性分析時發(fā)現(xiàn)，血清BMP-7水平與血WBC計數(shù)正相關(guān)，與IgA水平呈負(fù)相關(guān)，但未見相關(guān)文獻(xiàn)報道，故暫視為偶然結(jié)果；血清BMP-7與血清白蛋白呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合既往研究，考慮與炎性因子抑制肝細(xì)胞合成白蛋白有關(guān)。DAS28是評價RA病情活動的常用指標(biāo)，但本研究未證實血清BMP-7水平與其有關(guān)，可能與BMP-7與腫脹及壓痛關(guān)節(jié)數(shù)無關(guān)有關(guān)。盡管如此，上述結(jié)果仍然能夠提示BMP-7可能參與了RA的關(guān)節(jié)炎癥過程，有可能作為評價病情活動的指標(biāo)，但仍需要進(jìn)一步研究BMP-7與MMP-3的關(guān)系，說明BMP-7與MMP-3升高是否有必然聯(lián)系。

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（編輯 王又冬）

Expression of Serum Bone Morphogenetic Protein 7 and Its ClinicalSignificance in Patientswith Rheumatoid Arthritis

FANGFang1，YUANHong-xia2，DINGShuang1，DUANHong-mei1，WUChun-ling1，LIUHai-na1，XIAOWei-guo1
（1.Department of Rheumatology and Immunology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.College of Nursing，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）

ObjectiveTo investigate the serum level of BMP-7 in patients with rheumatoid arthritis，and evaluate its clinical significance.Meth?odsA total of 46 patients with rheumatoid arthritis，22 patients with OA and 20 healthy volunteers were enrolled for the study.Serum BMP-7 and MMP-3 were detected with enzyme linked immunosorbent assay kit.The relationship between BMP-7 and MMP-3 and other clinical indexes were analyzed，and the BMP-7，MMP-3 differences of high disease activity group and non high disease activity group in RA patients were compared.Re?sultsThe serum BMP-7 level in RA patients，with an average of 2 440（ranged from 1 445 to 3 808）pg/mL，was higher than that of OA patients and health controls（1 560±1 462 pg/mL，1 508±1 176 pg/mL）（P＜0.001，P＜0.05）.The level of serum MMP-3 in patients with RA（67.02± 22.60 ng/mL）was higher than that of OA patients and healthy controls（46.50±21.72 ng/mL，23.70±17.61 ng/mL）（P＜0.05，P＜0.05）.There was no obvious difference of serum BMP-7 level in RA patients between the high disease activity group and non high disease activity group（P＞0.05），but the MMP-3 was higher in high disease activity group（P＜0.05）.RA serum BMP-7 was positively correlated with serum MMP-3，ESR，CRP，white blood cell，fibrinogen（r=0.307 3，P=0.037 8；r=0.332，P=0.024 3；r=0.4618，P=0.001 2；r=0.333 5，P=0.023 5；r=0.360 1，P= 0.015 1），but negatively correlated with serum albumin，immunoglobulin IgA（r=-0.336 5，P=0.022 2；r=-0.292 3，P=0.048 7），and not correlated with course，swollen jointcount，tenderjointcount，VAS score，hemoglobin，platelet，calcium ion，immunoglobulin IgG，immunoglobulin IgM，complement C3，complement C4.ConclusionBMP-7 is involved in RA joint inflammatory process and its level can be used as an index for evaluating RAdisease activity.

rheumatoid arthritis；bone morphogenetic protein 7；matrix metalloproteinase

R593.22

A

0258-4646（2014）09-0814-04

遼寧省醫(yī)學(xué)高峰建設(shè)工程項目（2010006）

方芳（1982-），女，講師，碩士.

肖衛(wèi)國，E-mail：XOnet5670@163.com

2014-05-09

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