骨形成蛋白7減輕葡聚糖硫酸鈉誘導的大鼠結腸炎癥及其機制

劉維新，周鳳，張紳，任益，王瑩，王婷

（中國醫科大學附屬第一醫院消化內科，沈陽110001）

骨形成蛋白7減輕葡聚糖硫酸鈉誘導的大鼠結腸炎癥及其機制

劉維新，周鳳，張紳，任益，王瑩，王婷

（中國醫科大學附屬第一醫院消化內科，沈陽110001）

目的探討骨形成蛋白7（BMP7）治療葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的大鼠結腸炎癥的療效及其機制。方法健康雄性大鼠60只，隨機平均分為正常對照組、DSS組（DSS誘導結腸炎癥組）及DSS+BMP7組（BMP7治療DSS誘導的結腸炎癥組），每組20只。正常對照組大鼠飲用滅菌水，DSS組及DSS+BMP7組大鼠每天飲用3.5%的DSS以建立腸炎模型，DSS+BMP7組隔日1次腹腔注射1 mL BMP7（0.1 μg/mL）。于第0、7、14及28天各組分別處死5只大鼠，采用組織學評分方法判斷炎癥程度，并于第28天采用流式細胞術檢測外周血中調節性T細胞（Treg）比例變化，切取結腸組織分別利用實時PCR及Western blot檢測Foxp3mRNA及蛋白的表達，采用ELISA法檢測血清中轉化生長因子β1（TGF-β1）水平。結果第7天時炎癥程度DSS+BMP7組和DSS組低于正常對照組（P＜0.05），但DSS+BMP7組與DSS組相比無統計學差異（P＞0.05）；第14和28天時DSS+BMP7組炎癥程度高于DSS組（P＜0.05），第28天時DSS+BMP7組與正常對照組相比無統計學差異（P＞0.05）。第28天時Treg細胞比例DSS組及DSS+BMP7組低于正常對照組，且DSS+BMP7組顯著高于DSS組（P＞0.05）；與正常對照組相比，DSS組和DSS+BMP7組中Foxp3的表達降低，且DSS+BMP7組高于DSS組（P＜0.05）。DSS組和DSS+BMP7組細胞因子TGF-β1水平低于正常對照組，且DSS+BMP7組高于DSS組（P＜0.05）。結論BMP7可能作用于Treg細胞，減輕DSS誘導的結腸炎性疾病。

骨形態發生蛋白7；調節性T細胞；結腸炎；轉化生長因子β1

炎癥性腸病是克羅恩病和潰瘍性結腸炎的總稱［1］，目前其發病機制尚未明確，人們認為主要與腸道微生態環境及免疫遺傳因素等有關［2］。在諸多因素中，免疫應答異常及過度炎性反應在炎癥性腸病中占主要作用［3］。調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）是一類在誘導和維持自身免疫耐受中起關鍵作用的調節性細胞，研究證實Treg細胞主要是CD4+CD25+Treg，通過抑制免疫應答，從而減緩炎癥性腸病的進展。骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）超家族成員，對組織的生長、分化具有調節作用，特別是對肺、腎、腸等組織的生成演化具有重要作用。在眾多的BMP亞型中，BMP7在腸道廣泛表達，BMP7通過刺激TGF-β1的產生對組織器官的修復起重要作用。應用BMP7后，肺部的纖維化狀態可以得到明顯的改善。還有學者發現，BMP參與了炎癥及免疫反應過程，其在心臟、肺組織及腎臟中的作用已有明確報道［4～6］，但之前大部分研究都著重于BMP7與組織器官纖維化的關系，在免疫方面尤其是對炎癥性腸病的作用目前還未見相關研究。本研究擬通過建立葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導的炎癥性腸病大鼠模型，并給予BMP7干預，檢測CD4+CD25+Treg細胞的變化及TGF-β1的改變，進一步探討BMP7對炎癥性腸病的作用和可能的機制，為進一步的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康雄性6～8周齡的SD大鼠60只，DSS購自美國Sigma公司；大鼠Treg細胞流式細胞分析染色試劑盒及Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；TGF-β1 ELISA試劑盒為美國eBioscience公司產品；逆轉錄及實時熒光定量PCR試劑盒購自北京百泰克科技有限公司；Western blot配膠試劑盒購自碧云天；Foxp3引物由美國Invitrogen公司合成；Foxp3一抗購自德國CST公司。其余材料均為實驗室自備。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腸炎模型的建立和分組：將大鼠隨機分為正常對照組、DSS組和DSS+BMP7組，每組20只。正常對照組每天飲用滅菌水，DSS組和DSS+BMP7組每天飲用含3.5%DSS的水，直至實驗結束。DSS+ BMP7組每隔1 d腹腔注射0.1 μg/mL的BMP7 1 mL，正常對照組和DSS組大鼠隔日腹腔注射生理鹽水1 mL。每日均對所有組別的大鼠進行觀察、稱重及評分。腸炎觀察指標包括體質量、腹瀉程度及結腸病變情況等。

1.2.2 取材：各組分別于第0、7、14及28天處死5只大鼠，處死前均采大鼠尾靜脈血用于檢測Treg細胞，且第28天的大鼠外周血細胞及結腸組織還將用于流式細胞及PCR檢測。選取每只大鼠的全段結腸，沿腸道方向縱行剖開，處理干凈糞便后觀察明確炎癥部位，截取組織進行Foxp3mRNA及蛋白表達的檢測并檢測血清中細胞因子TGF-β1水平以及外周血中Treg細胞的比例。

1.2.3 組織學炎癥程度評分：每日記錄大鼠的體質量、大便性狀和隱血情況。根據我們以往已發表的評分方法［7］，在光鏡下觀察結腸組織切片。無潰瘍、無炎癥、無肉芽腫、無纖維化、無病變各記0分；小潰瘍（＜3 mm）、輕度炎癥、有肉芽腫、病變局限于黏膜下層各記1分；大潰瘍（＞3 mm）、重度炎癥病變深度達肌層、重度纖維化各記2分。將評分相加，計算平均值。

1.2.4 大鼠外周血中Treg細胞的比例：選取第28天炎性反應差異最大的SD大鼠行流式細胞檢測，大鼠外周血的單個核細胞采用密度梯度離心法進行分離，濃度采用1×106/mL。將0.3 μL的抗CD4和抗CD25加入100 μL的上述細胞，4℃避光孵育45 min，離心5 min，PBS洗滌3次，加入200 μL固定液，4℃避光孵育60 min，離心5 min，之后2次采用PBS液洗滌，重懸細胞采用500 μL FACS緩沖液，最后將其進行流式細胞儀的檢測。

1.2.5 結腸組織Foxp3mRNA的表達：選取第28天炎性反應差異最大的SD大鼠行實時PCR（real time PCR，RT-PCR）檢測，提取結腸組織總RNA，將其逆轉錄合成cDNA，并將合成的cDNA為模板進行RTPCR檢測。RT-RCT反應體系中包含2 μL的cDNA、10 μL的SYBR Premix、1 μL的上下游引物各一個，0.4 μL ROX和5.6 μL去離子水。反應條件：95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，共進行40個循環。最后采用相對定量的方法（即2-△△Ct法）對Foxp3mRNA相對表達量進行計算。

1.2.6 Western blot檢測結腸組織Foxp3蛋白的表達：選取第28天炎性反應差異最大的SD大鼠行Western blot檢測，將結腸組織裂解，以獲取總蛋白，蛋白經定量后按照40 μg上樣進行電泳，電泳后轉膜，將轉膜后的PVDF膜放在甲醇中固定10 s左右，之后室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，用5%脫脂牛奶配置一抗，一抗濃度（1∶500），4℃封閉過夜，繼續室溫下二抗封閉1 h，之后利用ECL發光液進行顯色。

1.2.7 ELISA法檢測血清TGF-β1水平：選取第28天炎性反應差異最大的SD大鼠行ELISA法檢測。用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10 μg/mL，每孔加0.1 mL，4℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品0.1 mL于上述已包被的反應孔中，置于37℃中孵育1 h后洗滌。在反應孔中加入新鮮稀釋的酶標二抗0.1 mL，在37℃中孵育30～60 min后洗滌，最后一遍用超輕水洗滌。然后加底物液顯色；于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1 mL，37℃10～30 min。最后在各反應孔中加入2 mol/L硫酸0.05 mL終止反應。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 處理前后腸炎程度評分

DSS+BMP7組與DSS組在第0天差異無統計學意義（P＞0.05）。DSS組在第7、14、28天炎癥程度評分明顯高于正常對照組。DSS+BMP7組第7天與DSS組相比無統計學差異（P＞0.05），而第14天較DSS組減輕（P＜0.05），第28天DSS+BMP7組炎癥程度評分明顯低于DSS組（P＜0.05），與正常對照組相比無統計學差異（P＞0.05）。見表1。

表1 DSS和BMP7處理前后各組炎癥程度評分Tab.1 The degree of colon inflammation in different groups before and after treatment with DSS and BMP7

2.2 流式細胞儀檢測外周血中CD4+CD25+Treg細胞比例

外周血中CD4+CD25+Treg細胞比例DSS+BMP7組顯著高于DSS組（P＜0.01），但DSS+BMP7組與正常對照組比較比例略低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 外周血中CD4+CD25+Treg細胞比例Fig.1 The percentage of CD4+CD25+Treg cells in peripheral blood

2.3 RT-PCR檢測結腸組織中Foxp3mRNA表達

RT-PCR檢測結果顯示，DSS+BMP7組特異性表達于CD4+CD25+Treg細胞的Foxp3mRNA水平明顯高于DSS組（P＜0.01），但較正常對照組低（P＜0.05），見圖2。

圖2 RT?PCR檢測結腸組織中Foxp3mRNA的表達Fig.2 RT?PCR detection of the expression of Foxp3 mRNA in colon

2.4 Western blot檢測結腸組織Foxp3蛋白的表達

Western blot結果顯示，DSS+BMP7組特異性表達于CD4+CD25+Treg細胞的Foxp3蛋白水平明顯高于DSS組，但較正常對照組低。見圖3。

圖3 Western blot檢測結腸組織Foxp3蛋白的表達Fig.3 Western blot detection of the expression of Foxp3 in colon tissue

2.6 ELISA法檢測血清TGF-β1水平

ELISA法檢測顯示，DSS+BMP7組TGF-β1表達量（60.14±3.12）顯著高于DSS組（22.35±4.59）（P＜0.05），但與正常對照組（71.56±462）相比其表達較低（P＜0.05）。

3 討論

炎癥性腸病是一類慢性非特異性腸道炎癥，主要包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病［1］，其病因和發病機制目前尚不明確，目前認為多種因素參與了炎癥性腸病的發生發展過程，免疫、微生物群體、生物環境以及遺傳等因素都對潰瘍性結腸炎的發生和發展具有一定影響［8］。目前較為普遍的觀點認為發動病變的始動因素是免疫耐受和免疫反應之間的平衡被打破，即腸道的免疫功能失調［9］。

Treg細胞可分為自然調節性T細胞和誘導產生調節性T細胞，如Th3、Tr1，另外還有CD8 Treg、自然殺傷T細胞等幾種亞型，這些與自身免疫性疾病的發生關系密切，其異常表達可導致自身免疫性疾病［10］。自然調節性T細胞主要為CD4+CD25+Treg，有研究將CD4+CD25+Treg缺陷的小鼠的T細胞轉移到裸鼠中會導致多種自身免疫性疾病，而預先輸入CD4+CD25+Treg可預防這類疾病的發生。將正常小鼠脾臟的CD4+T細胞去除CD25+細胞后轉移給同基因型T細胞缺陷小鼠，將導致各種器官特異性自身免疫性疾病和系統性消耗疾病，而注射CD4+CD25+細胞群可以抑制這些自身免疫疾病的發生，從而最早證明了該群細胞具備免疫調節能力。CD4+CD25+Treg約占外周血及脾臟CD4+T細胞的5%～10%，CD4+CD25+Treg除表達CD4分子和CD25分子外，其特征標志為其高表達轉錄因子Foxp3。Foxp3不僅能作為CD4+CD25+Treg的標志分子，還是決定CD4+CD25+Treg功能的關鍵基因［11］。

Treg細胞的表型和功能都比較特異，這類細胞產生于胸腺，產生后運輸至血液循環中，通過自主調節的方式抑制自身反應性T細胞的增殖及進一步活化，并且分泌抑制性細胞因子TGF-β1等物質來調節T細胞的增殖、分化以及其活性。CD4+CD25+Treg細胞能通過抑制免疫應答，從而減緩自身免疫性疾病的發生發展，包括炎癥性腸病［12］。

BMP7是TGF-β超家族中成員之一，對組織器官的修復起重要作用，而過度表達則造成組織的纖維化［13］。之前大部分研究都著重于BMP與組織器官纖維化關系的研究［14］，在免疫方面報道甚少。本文通過構建免疫相關炎癥性腸病大鼠模型，通過給予BMP7來觀察動物的炎性反應情況是否發生變化，從而進一步探討其減緩炎癥性腸病病情的機制是否通過Treg細胞來發揮起免疫抑制功能。

本研究表明，DSS+BMP7組給予BMP7治療后，相比DSS組腸道炎癥表現明顯減輕，且相關免疫耐受因子TGF-β1及特異性表達于CD4+CD25+Treg細胞的Foxp3基因表達水平都明顯增高。因此我們認為，給予BMP7治療炎癥性腸病有一定的療效。而對其在分子水平上是如何進一步相互作用還需進一步研究。

［1］Saxena A，Kaur K，Hegde S，et al.Dietary agents and phytochemicals in the prevention and treatment of experimental ulcerative colitis［J］.Tradit Complement Med，2014，4（4）：203-217.

［2］Di Sabatino A，Biancheri P，Rovedatti L，et al.Recent advances in understanding ulcerative colitis［J］.Intern Emerg Med，2012，7（2）：103-111.

［3］Maul J，Zeitz M.Ulcerative colitis：immune function，tissue fibrosis and current therapeutic considerations［J］.Langenbecks Arch Surg，2012，397（1）：1-10.

［4］Maric I，Kucic N，Turk WT，et al.BMP signaling in rats with TNBS-induced colitis following BMP7 therapy［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2012，302（10）：G1151-G1162.

［5］Flier SN，Tanjore H，Kokkotou EG，et al.Identification of epithelial to mesenchymal transition as a novel source of fibroblasts in intestinal fibrosis［J］.J Biol Chem，2010，285（26）：20202-20212.

［6］Maric I，Poljak L，Zoricic S，et al.Bone morphogenetic protein-7 reduces the severity of colon tissue damage and accelerates the healing of inflammatory bowel disease in rats［J］.J Cell Physiol，2003，196（2）：258-264.

［7］劉維新，張紳，任益，等.潰瘍性結腸炎及潰瘍性結腸炎相關性結直腸癌小鼠模型中血管生成因子的表達及其與血管新生的關系［J］.中國醫科大學報，2012，41（5）：231-234.

［8］Krishnan K，Arnone B，Buchman A.Intestinal growth factor：potential use in the treatment of inflammatory bowel disease and their role in mucosal healing［J］.Inflamm Bowel Dis，2011，17（1）：410-422.

［9］Bamias G，Kaltsa G，Ladas SD.Cytokines in the pathogenesis of ulcerative colitis［J］.Discov Med，2011，11（60）：459-467.

［10］Ephrem A，Epstein AL，Stephens GL，et al.Modulation of Treg cells/T effector function by GITR signaling is context-dependent［J］.Eur J Immunol，2013，43（9）：2421-2429.

［11］Gibson DJ，Ryan EJ，Doherty GA.Keeping the bowel regular：the emerging role of Treg as a therapeutic target in inflammatory bowel disease［J］.Inflamm Bowel Dis，2013，19（12）：2716-2724.

［12］Mayne CG，Williams CB.Induced and natural regulatory T cells in the development of inflammatory bowel disease［J］.Inflamm Bowel Dis，2013，19（8）：1772-1788.

［13］Chu GC，Dunn NR，Anderson DC，et al.Differential requirements for Smad4 in TGF beta-dependent patterning of the early mouse embryo［J］.Development，2004，131（15）：3501-3512.

［14］Lavery K，Hawley S，Swain P，et al.New insights into BMP-7 mediated osteoblastic differentiation of primary human mesenchymal stem cells［J］.Bone，2009，45（1）：27-41.

（編輯 陳姜）

Bone Morphogenetic Protein 7 Alleviates Inflammation in the Rat Colitis Induced by Dextran Sodium Sulfate and Its Mechanism

LIU Wei-xin，ZHOUFeng，ZHANGShen，RENYi，WANGYing，WANGTing
（DepartmentofDigestive Diseases，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo detect the curing effect of bone morphogenetic protein 7（BMP7）in the colitis model of rat induced by dextran sodium sulfate（DSS）and its mechanism.MethodsA total of 60 rats were randomly divided into normal control group（treated by normal saline），DSS group（colitis model induced by DSS）and DSS+BMP7 group（DSS induced colitis model treated by BMP7）.After 0，7，14，and 28 days，5 rats of each group were killed.The degree of colon inflammation was evaluated，the peripheral blood was analyzed by flow cytometry to detect changes in regulatory T（Treg）cellpercentage，and the colorectaltissueswere analyzed forFoxp3mRNA and protein expression using realtime PCRand Western blot.ELISA assay was used to detect the levels of serum cytokines transforming growth factor β1（TGF-β1）.ResultsThe degrees of colon inflammation in the DSS group and DSS+BMP7 group were significantly higher than that of the control group on day 7.The degree of colon inflammation of the DSS+BMP7 group was lower than that of the DSS group（P＜0.05）on day 14 and day 28.The percentage of Treg cell and the expression levels of Foxp3 and TGF-β1 in the DSS group and DSS+BMP7 group were lower than those in the control group，and the expression levels in the DSS+BMP7 group were higher than those in the DSS group（P＜0.05）on day 28.ConclusionBMP7 may alleviate the colitis DSS induced by increasing Treg cells and TGF-β1.

bone morphogenetic protein 7；regulatory T cell；colitis；transforming growth factor β1

R574.62

A

0258-4646（2014）12-1084-04

遼寧省科技攻關計劃（2013225303）

劉維新（1966-），女，副教授，博士. E-mail：weixinliu@yahoo.com

2014-10-22

網絡出版時間：