細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2抑制劑U0126上調(diào)腦缺血再灌注小鼠海馬微管結(jié)合蛋白2的表達(dá)

王海波，朱春瑩，包義君，陳書達(dá)，郭宗澤，仇波

（1.浙江省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，杭州310014；2.浙江省杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院臨床心理科，杭州311200；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽(yáng)110001）

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2抑制劑U0126上調(diào)腦缺血再灌注小鼠海馬微管結(jié)合蛋白2的表達(dá)

王海波1，朱春瑩2，包義君3，陳書達(dá)1，郭宗澤3，仇波3

（1.浙江省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，杭州310014；2.浙江省杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院臨床心理科，杭州311200；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽(yáng)110001）

目的探討細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2抑制劑U0126對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠海馬微管結(jié)合蛋白2（MAP-2）表達(dá)的影響。方法健康昆明小鼠150只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組和U0126組，每組50只，各組再根據(jù)缺血后再灌注的時(shí)間點(diǎn)細(xì)分為6、12、24、48和72 h 5個(gè)亞組。利用免疫組織化學(xué)方法和Western blot方法檢測(cè)MAP-2在各組小鼠海馬的表達(dá)變化，同時(shí)應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)各組小鼠海馬細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組小鼠海馬MAP-2的表達(dá)在6 h時(shí)已經(jīng)明顯降低，24 h達(dá)最低值，而在72 h略有回升（P＜0.01）；與相同時(shí)間點(diǎn)的缺血再灌注組小鼠相比，U0126組小鼠海馬MAP-2的表達(dá)明顯升高（P＜0.01），而且海馬細(xì)胞的凋亡情況明顯好轉(zhuǎn)（P＜0.01）。結(jié)論U0126能夠上調(diào)腦缺血再灌注損傷小鼠海馬MAP-2的表達(dá)，減少腦缺血再灌注損傷海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

腦缺血再灌注；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2；U0126；海馬；細(xì)胞凋亡；小鼠

缺血性腦血管病約占腦血管疾病的70%以上，是威脅人類健康的一個(gè)重要因素。腦梗死后可發(fā)生一系列病理生理變化，進(jìn)一步損害腦功能，導(dǎo)致相應(yīng)的后遺癥，因此腦梗死的臨床和基礎(chǔ)研究一直是神經(jīng)科學(xué)的熱點(diǎn)。作為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種磷蛋白質(zhì)，微管相關(guān)蛋白2（microtubule associated protein 2，MAP-2）是結(jié)構(gòu)性微管相關(guān)蛋白家族的一員，在微管蛋白組裝、細(xì)胞骨架形成、細(xì)胞突起生成及胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫婢鹬匾饔茫?～3］。有研究報(bào)道，在大鼠局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭写竽X組織MAP-2表達(dá)減少［4］。此外有研究發(fā)現(xiàn)將鼠大腦中動(dòng)脈閉塞2 h后予以再灌注的不同時(shí)點(diǎn)，大部分缺血核心區(qū)可以觀察到MAP-2免疫反應(yīng)消失［5］。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是最初發(fā)現(xiàn)的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族亞類，是一種保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，許多生長(zhǎng)因子、細(xì)胞素、激素及介導(dǎo)有絲分裂、分化的信號(hào)均可激活ERK，使其發(fā)生磷酸化而活化。研究發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血再灌注后磷酸化ERK表達(dá)增加，參與缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡和非程序性死亡過(guò)程，但是其具體作用機(jī)制尚不清楚［6］。本研究利用ERK抑制劑U0126阻斷腦缺血再灌注后ERK的表達(dá)，觀察腦缺血再灌注損傷小鼠海馬MAP-2表達(dá)的變化，為闡明ERK信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

兔抗小鼠MAP-2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，羊抗兔多克隆二抗、TUNEL試劑盒和SP免疫組化試劑盒均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司，其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 動(dòng)物模型

150只健康昆明小鼠（20～30 g），購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=50）、缺血再灌注組（n=50）和U0126抑制劑組（n=50）。用0.8%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，固定，備皮消毒，切開頸前皮膚，暴露兩側(cè)頸總動(dòng)脈，缺血再灌注組和U0126抑制劑組采用夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈造成短暫前腦缺血12 min，U0126抑制劑組在缺血后從右側(cè)頸總動(dòng)脈由微量注射器注入U(xiǎn)0126（0.2 mg/kg）。除去微動(dòng)脈夾，縫合切口，消毒皮膚。術(shù)中保持室內(nèi)溫度25℃，保持肛溫37℃。假手術(shù)組只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈12 min。然后每組根據(jù)再灌注的時(shí)間點(diǎn)細(xì)分為6、12、24、48、72 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)亞組。

1.3 免疫組織化學(xué)方法

各組小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)以0.8%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉、開胸、經(jīng)左心室灌注生理鹽水洗凈血液，以4℃的4%多聚甲醛固定后開顱取腦，并固定24 h。經(jīng)20%～30%蔗糖及常規(guī)等級(jí)乙醇進(jìn)行一系列脫水過(guò)程，制成蠟塊，形成厚約6 μm的連續(xù)切片。切片脫蠟后以3%H2O2孵育15 min，經(jīng)PBS清洗及抗原修復(fù)后，與MAP-2抗體（1∶100）于4℃冰箱孵育過(guò)夜；PBS清洗后加入二抗于37℃溫箱共孵育20 min；然后經(jīng)PBS清洗及DAB顯色、脫水、透明、封片。結(jié)果采用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定小鼠海馬區(qū)陽(yáng)性反應(yīng)物的平均光密度值。

1.4 Western blot方法

各組小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)以0.8%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，冰上斷頭取腦，按體積比1∶5加入蛋白裂解液RIPA及1 μL的PMSF，提取總蛋白，按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行總蛋白定量，形成標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出樣品的蛋白濃度。樣品加入5×緩沖液、變性、電泳、轉(zhuǎn)膜后，加入一抗后4℃下孵育過(guò)夜，然后室溫下與二抗反應(yīng)2 h，以Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)電泳結(jié)果，并用軟件分析條帶信號(hào)，蛋白相對(duì)表達(dá)水平以目的基因的條帶信號(hào)強(qiáng)度與內(nèi)參基因GAPDH的條帶信號(hào)強(qiáng)度比值表示。

1.5 TUNEL染色

凋亡細(xì)胞檢測(cè)采用TUNEL染色，按照原位凋亡試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，DAB顯色。凋亡陽(yáng)性細(xì)胞記數(shù)方法：每張切片于高倍鏡下隨機(jī)采集5個(gè)非重疊視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)，取高倍視野平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組小鼠海馬MAP-2的表達(dá)在6 h時(shí)已經(jīng)明顯降低，48 h表達(dá)量最低，72 h略有回升（P＜0.05）；與相同時(shí)間點(diǎn)的缺血再灌注組小鼠比較，U0126組小鼠海馬MAP-2的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。見圖1、表1。

2.2 Western blot結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，各時(shí)間點(diǎn)的缺血再灌注組小鼠海馬MAP-2的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與相同時(shí)間點(diǎn)的缺血再灌注組小鼠比較，U0126組小鼠海馬MAP-2的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。見圖2、表2。

2.3 TUNEL結(jié)果

TUNEL陽(yáng)性染色為細(xì)胞核棕黃色顆粒。TUNEL結(jié)果顯示，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞逐漸增多，至48 h達(dá)到峰值。與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組凋亡細(xì)胞顯著增加（P＜0.05）；與相同時(shí)間點(diǎn)的缺血再灌注組小鼠比較，U0126組小鼠海馬凋亡細(xì)胞顯著減少（P＜0.05）。見圖3、表3。

圖1 免疫組化檢測(cè)各組小鼠海馬MAP?2的表達(dá)×200Fig.1 Immunohistochemical detection of the expression of MAP?2 in the hipppocampal region of mice×200

表1 各組小鼠海馬MAP?2光密度值比較Tab.1 The optical density values of MAP?2 in the hippocampus of mice in different groups

圖2 Western blot檢測(cè)各組小鼠海馬MAP?2的表達(dá)Fig.2 Western blot detection of the expression of MAP?2 in the hipppocampal region of mice

表2 各組小鼠海馬MAP?2平均光密度值比較Tab.2 The optical density values of MAP?2 in the hippocampus of mice in different groups

圖3 TUNEL檢測(cè)各組小鼠海馬細(xì)胞凋亡×400Fig.3 TUNEL detection of the cell apoptosis in mice hippocampus×400

表3 各組小鼠海馬細(xì)胞凋亡數(shù)比較Tab.3 The number of apoptosis cells in the hippocampus of mice in different groups as detected by TUNEL

3 討論

缺血性腦血管病是一種發(fā)病率較高的疾病，而且預(yù)后較差，致死致殘率高。由于其發(fā)病在腦缺血時(shí)，尤其是在快速、急劇的腦缺血時(shí)，腦的氧供和能量代謝被打亂，導(dǎo)致部分神經(jīng)元內(nèi)依賴能量的基因調(diào)控來(lái)不及表達(dá)就開始凋亡，因此在缺血周圍區(qū)出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞。如果不能及時(shí)給予有效的治療，凋亡細(xì)胞則趨于死亡。因此，促進(jìn)缺血再灌注損傷細(xì)胞的功能逆轉(zhuǎn)，減少細(xì)胞壞死，是治療缺血性腦血管疾病的一個(gè)重點(diǎn)［7］。

各種生長(zhǎng)因子、離子射線、過(guò)氧化氫等可將ERK1和ERK2磷酸化而激活，它和細(xì)胞的增殖與分化密切相關(guān)［8，9］。ERK1和ERK2磷酸化被激活后，通過(guò)在細(xì)胞核內(nèi)作用于多種轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血再灌注后磷酸化ERK表達(dá)增加，參與缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡和非程序性死亡過(guò)程［1］。小鼠海馬部位屬于缺血敏感區(qū)，在本研究中缺血再灌注后細(xì)胞凋亡明顯高于假手術(shù)組。通過(guò)TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠海馬凋亡細(xì)胞數(shù)量迅速增多，表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)棕黃色顆粒明顯增加。在24～48 h期間內(nèi)細(xì)胞凋亡速度顯著增快，至48 h達(dá)到峰值。利用ERK抑制劑U0126阻斷腦缺血再灌注小鼠ERK的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注組小鼠海馬凋亡細(xì)胞相比于同一時(shí)間點(diǎn)的U0126抑制劑組小鼠顯著減少（P＜0.05），說(shuō)明U0126通過(guò)抑制ERK1/2信號(hào)通路從而阻斷神經(jīng)細(xì)胞凋亡和非程序性死亡，從而改善缺血再灌注后的海馬細(xì)胞進(jìn)一步損害。從以上結(jié)果可以推斷，ERK被U0126抑制后，ERK啟動(dòng)的一系列凋亡信號(hào)通路被阻斷，使細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子無(wú)法活化，從而抑制細(xì)胞的分化、凋亡，進(jìn)而影響了缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡和非程序性死亡過(guò)程，這與之前的研究結(jié)果一致［1］。但是ERK參與缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡和非程序性死亡的信號(hào)機(jī)制，尚需進(jìn)一步深入研究。

MAP-2主要在神經(jīng)元胞體、樹突、樹突棘表達(dá)，對(duì)于神經(jīng)功能來(lái)講，MAP-2與突觸后膜骨架上一些信號(hào)蛋白和膜受體相連，是許多神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)通路的底物，也是調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性以及細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的必需因子，樹突的分化離不開MAP-2的表達(dá)，神經(jīng)元MAP-2的丟失涉及到神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞和神經(jīng)元死亡，進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙［10］。有研究報(bào)道，在大鼠局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭校竽X組織中的MAP-2表達(dá)顯著降低［4］，說(shuō)明其低表達(dá)與腦缺血過(guò)程密切相關(guān)；這種相關(guān)性可能與腦缺血缺氧后引起酸中毒，使MAP-2抗原性減低有關(guān)，但是其具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究中免疫組化顯示缺血再灌注組MAP-2的表達(dá)在6 h時(shí)已經(jīng)明顯降低，至48 h時(shí)表達(dá)量最低，這一趨勢(shì)與遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的時(shí)間進(jìn)程相符。以上結(jié)果提示MAP-2的分解破壞或合成障礙，可能參與了腦缺血再灌注后的損傷機(jī)制。而同一時(shí)間點(diǎn)U0126組小鼠海馬MAP-2的表達(dá)比缺血再灌注組顯著升高，凋亡細(xì)胞數(shù)量也相應(yīng)減少，印證了以上的推測(cè)。近幾年，越來(lái)越多的人意識(shí)到MAP-2免疫活性的高低與腦損傷的關(guān)系，并且其可作為腦缺氧缺血后神經(jīng)細(xì)胞受損及再生的評(píng)價(jià)指標(biāo)［11］。在本研究中，缺血再灌注組小鼠海馬MAP-2的免疫活性明顯減低，而利用ERK抑制劑U0126阻斷腦缺血再灌注小鼠ERK的表達(dá)后，相同時(shí)間點(diǎn)的U0126抑制劑組小鼠海馬MAP-2的表達(dá)卻顯著升高，說(shuō)明ERK的阻斷能夠上調(diào)MAP-2的表達(dá)，從而改善了小鼠海馬在缺血再灌注后的進(jìn)一步損傷，減輕了細(xì)胞凋亡程度。結(jié)合文獻(xiàn)和本研究結(jié)果，下調(diào)MAP-2的表達(dá)很可能是ERK1/2信號(hào)通路參與缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡和非程序性死亡的信號(hào)機(jī)制之一。

綜上所述，ERK信號(hào)通路及ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能通過(guò)下調(diào)MAP-2表達(dá)，從而參與了腦缺血再灌注損傷，導(dǎo)致了進(jìn)一步的細(xì)胞凋亡；而ERK抑制劑U0126則可阻斷這個(gè)病理過(guò)程，從而改善小鼠海馬損傷。

以上結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步研究腦缺血再灌注后的病理生理過(guò)程以及相應(yīng)的信號(hào)通路提供了新的思路，同時(shí)也在一定程度上為腦缺血再灌注損傷的臨床治療提供了理論依據(jù)，但相關(guān)信號(hào)通路的具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步的深入研究。

［1］Nunez J.Immature and mature variants of MAP-2 and tau proteins and neuronal plasticity［J］.Trends Neurosei，2005，11（11）：477-499.

［2］Kowalski RJ，Williams RC.Microtubule-associated protein 2 alters the dynamic properties of microtubule assembly and disassembly［J］.Biol Chem，2003，268（13）：9847-9855.

［3］劉正清，馬志健，劉裕民.微管相關(guān)蛋白2與神經(jīng)元可塑性調(diào)節(jié)［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2003，13（9）：51-54.

［4］An SJ，See MO，Kim HS，et a1.Accumulation of microtubule-associated proteins in the hippocampal neurons of seizure-sensitive gerbils［J］.Mo1 Cells，2003，15（2）：200-207.

［5］Buddle M，Eberhardt E，Climinello LH，et a1.Microtubule-associated protein 2（MAP2）associates with the NMDA receptor and is spatially redistributed within rat hippocampal neurons after oxygeng1ucose deprivation［J］.Brain Res，2003，978（1-2）：38-50.

［6］潘蓓，劉瑞珍，謝寶明.大鼠局灶性腦缺血再灌注后p-ERK表達(dá)及神經(jīng)元凋亡的變化［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40（5）：433-437.

［7］許妍妍，劉麗莉，劉春春，等.缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)bcl-2、bax和p53的動(dòng)態(tài)表達(dá)［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，38（4）：697-702.

［8］Wu N，Lin X，Zhao X，et al.MiR-125b acts as an oncogene in glioblastoma cells and inhibits cell apoptosis through p53 and p38MAPK-independent pathways［J］.Br J Cancer，2013，109（11）：2853-2863.

［9］吳獻(xiàn)偉，楊華圣，吳麗，等.細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶蛋白在全腦缺血再灌注損傷后的表達(dá)及與凋亡的關(guān)系［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2010，15（2）：103-104.

［10］鄭峰，吳家冪.微管相關(guān)蛋白2與缺血性腦損傷［J］.神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生，2005，5（2）：154-156.

［11］顧衛(wèi)東，陳群，曾因明，等.腦缺血再灌注期間海馬神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白-2免疫活性的變化［J］.中國(guó)麻醉醫(yī)學(xué)，2000，20（5）：318.

（編輯 陳姜）

ERK1/2 Blocker U0126 Upregulates the Expression of Microtubule Associated Protein 2 in Hippocampusof CerebralIschemia Reperfusion Mice

WANGHai-bo1，ZHU Chun-ying2，BAOYi-jun3，CHENShu-Da1，GUO Zong-ze3，QIUBo3
（1.DepartmentofNeurosurgery，Zhejiang ProvincialPeople′s Hospital，Hangzhou 310014，China；2.ClinicalPsychology，Xiaoshan FirstPeople′s Hospital，Hangzhou 311200，China；3.DepartmentofNeurosurgery，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effectofextracellularsignal-regulated kinase 1/2 blocker U0126 on the expression ofmicrotubule associated protein 2（MAP-2）in hippocampus ofcerebralischemia-reperfusion injury mice.MethodsAtotalof150 Kunming mice were randomly divided into sham group，cerebralischemia-reperfusion group，and U0126 group（n=50 each group），which were then subdivided into five subgroups according to the time point of reperfusion after ischemia（6，12，24，48 and 72 h）.Immunohistochemistry method and Western blot method were employed to detectthe expression ofMAP-2 in hippocampus ofmice，and apoptosisofhippocampus cells in mice was detected by TUNELmethod.Re?sultsCompared with the control group，the expression of MAP-2 in hippocampus of mice in the ischemia-reperfusion group was significantly increased within 6 h，became barely detectable at 24 h，and rebounded slightly at 72 h（P＜0.01）.Compared with mice in the ischemia-reperfusion group，the expression of MAP-2 in hippocampus of mice in the U0126 group at the same time point was significantly increased（P＜0.01），and the number of hippocampal cells apoptosis was decreased（P＜0.01）.ConclusionU0126 could upregulate the expression of MAP-2 in hippocampus ofcerebralischemia-reperfusion injury mice，and decrease apoptosisofhippocampalneuralcellsinduced by cerebralischemia-reperfusion injury.

cerebral ischemia-reperfusion；extracellular signal-regulated kinase 1/2；U0126；hippocampus；cell apoptosis；mouse

R743

A

0258-4646（2014）12-1092-05

教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（教外司留［2013］1792號(hào)）；遼寧省博士啟動(dòng)基金（20111095）

王海波（1982-），男，醫(yī)師，碩士.

朱春瑩，E-mail：172839554@qq.com

2014-09-23

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