LDL?R基因多態(tài)性與丙型肝炎易感性的相關(guān)性分析

張青楊，金丹寧，金國江，康輝，尚紅

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽110001）

LDL?R基因多態(tài)性與丙型肝炎易感性的相關(guān)性分析

張青楊，金丹寧，金國江，康輝，尚紅

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽110001）

目的探討低密度脂蛋白受體（LDL-R）基因rs688 C/T、rs5925 C/T單核苷酸多態(tài)性（SNP）與丙型肝炎易感性之間的相關(guān)性。方法采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）結(jié)合高分辨率熔解曲線（HRM-PCR）的方法，對179例丙型肝炎病毒（HCV）感染者和178名體檢健康者或無病毒性肝炎史的其他疾病患者基因rs688和rs5929兩個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測。結(jié)果在HCV感染組和未感染HCV對照組之間，LDL-RSNP中rs688和rs5925分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論rs688和rs5925這兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)可能與丙型肝炎感染無相關(guān)性。

低密度脂蛋白受體；基因多態(tài)性；高分辨率熔解曲線；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；丙型肝炎

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染引起的主要經(jīng)血液傳播的一種肝臟疾病，目前全球有1.3～1.5億感染者，且丙型肝炎起病隱匿，慢性化率高達(dá)55%～85%，與肝硬化、肝細(xì)胞癌等密切相關(guān)［1］。研究表明，HCV感染后，無論是肝臟的損傷程度，發(fā)展成肝硬化或肝細(xì)胞癌的進(jìn)程還是對藥物的治療反應(yīng)，個(gè)體差異均很大［2，3］，說明宿主的遺傳因素，如單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）等對于丙型肝炎的臨床表現(xiàn)及疾病進(jìn)展起到重要的作用［4］。低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDL-R）是HCV主要膜蛋白受體，其編碼基因位于人類第19號染色體短臂末端（p13.1～13.3）［5～7］，與CD81以及EGFR等細(xì)胞因子共同作用，使HCV進(jìn)入人體細(xì)胞內(nèi)并發(fā)生作用［8，9］。LDL-R基因多態(tài)性可引起LDL-R的功能變化［10］，而這種功能變化與丙型肝炎發(fā)病的相關(guān)性目前研究較少。

本研究采用高分辨率熔解曲線結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（high resolution melt-polymerase chain reaction，HRM-PCR）的方法對LDL-RSNP進(jìn)行分析，獲得LDL-R基因rs688 C/T、rs5925 C/T SNP在中國東北地區(qū)人群中的分布情況，旨在探索LDL-R基因rs688 C/T、rs5925 C/T SNP與丙型肝炎易感性之間的相關(guān)性，為及早發(fā)現(xiàn)易感人群為實(shí)施更為積極有效的防護(hù)措施、防治HCV感染的發(fā)生提供幫助。

1 材料與方法

1.1 研究對象

丙型肝炎組：選取2011年11月至2012年11月在本院就診的丙型肝炎患者179例，納入標(biāo)準(zhǔn)為抗-HCV陽性、HCV-RNA結(jié)果陽性且通過血清學(xué)檢查排除其他肝炎病毒感染、未接受治療的丙型肝炎患者，其中男性106例（59.4%），女性73例（40.6%），年齡范圍20～84歲，平均年齡（53.77±12.93）歲。正常對照組：選取本院同期的體檢健康者或無病毒性肝炎史的其他疾病患者178例，其中男性97例（54.5%），女性81例（45.5%），年齡范圍24～76歲，平均年齡（50.58±14.99）歲。丙型肝炎組和正常對照組在性別和年齡構(gòu)成上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為P=0.99和P=0.21）。

所有研究對象均知情同意，且均無I型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病史。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取：采用QIAGEN公司QIAamp?DNA Micro Kit進(jìn)行外周血基因組DNA提取，具體操作步驟按照其說明書進(jìn)行。用核酸定量儀測定DNA濃度及純度，并凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2LDL-R基因SNP的檢測：采用HRM-PCR結(jié)合混樣法對研究對象LDL-R基因rs688和rs5925進(jìn)行檢測。

應(yīng)用PREMIER5.O軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并由上海生工生物工程有限公司合成。引物設(shè)計(jì)原則為確保引物的退火溫度在55～60℃左右，并且擴(kuò)增產(chǎn)物盡可能短（100～150）bp。引物及擴(kuò)增產(chǎn)物信息見表1。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小Tab.1 Polymerase chain reaction primers and amplicons

PCR反應(yīng)體系：LightCycler?480 High Resolution Melting Master Mix（內(nèi)含PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP、FastStart Taq DNA酶和HRM染料），10 mmol/L dNTP液0.2 μL、TaqDNA聚合酶0.2 μL、10×PCR緩沖液1μL、引物各0.1 μL、LCGreen PLUS飽和熒光染料1μL，模板1μL，加滅菌去離子水至10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)品的制備及HRM-PCR反應(yīng)條件：標(biāo)準(zhǔn)品由前期直接測序獲得。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min、95℃變性10 s、55℃退火延伸30 s共50個(gè)循環(huán)。在進(jìn)行HRM分析之前，進(jìn)行變性和復(fù)性處理：95℃30 s，60℃10 s。HRM過程從65℃開始，以0.02℃/s的斜率采集溶解曲線，到95℃結(jié)束，并在LightCycler480基因掃描軟件模塊上進(jìn)行分析。每次反應(yīng)均需將已知基因型的標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣本同時(shí)進(jìn)行檢測。根據(jù)HRM曲線的形狀判斷基因型，與標(biāo)準(zhǔn)品曲線形狀相同者被認(rèn)定為與標(biāo)準(zhǔn)品基因型相同，從而獲得未知待測樣品的基因型。

1.2.3 測序驗(yàn)證

為證實(shí)HRM-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機(jī)抽取40份PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SNP的基因型頻率和等位基因頻率通過計(jì)數(shù)得到。運(yùn)用Haploview4.0軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：組間等位基因頻率和基因型分布差異采用卡方檢驗(yàn)；多態(tài)性位點(diǎn)與丙型肝炎患病風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性用比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區(qū)間（CI）表示。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1LDL-R基因SNP的篩查

應(yīng)用HRM-PCR結(jié)合混樣法成功獲得所有待測標(biāo)本LDL-R基因rs688和rs5925 SNP的基因分型。HRM-PCR結(jié)果用差異視圖顯示，見圖1。

2.2 遺傳平衡檢驗(yàn)

為檢驗(yàn)本研究人群LDL-R基因rs688和rs5925基因型頻率是否具有群體代表性，將丙型肝炎組及正常對照組人群的基因型頻率分別進(jìn)行遺傳平衡檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示觀察值和期望值均溫和良好（rs688：丙型肝炎組χ2=0.486，P=0.486；正常對照組χ2=0.052，P=0.819；rs5925：丙型肝炎組χ2=0.502，P= 0.479；正常對照組χ2=0.040，P=0.842），符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，證明本研究人群已達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性（表2）。

圖1 LDL?R基因SNP的HRM?PCR分型結(jié)果Fig.1 Genotyping results using HRM?PCR of LDL?R SNPs

表2 研究群體的遺傳平衡檢驗(yàn)Tab.2 Genetic research groups balancing test

2.3 對照人群及丙型肝炎人群LDL-R基因SNP分布

本研究中，對照人群LDL-R基因rs688位點(diǎn)CC、CT、TT 3種基因型分布頻率分別為70.8%、27.0%和2.2%，而等位基因C的頻率為84.3%，等位基因T的頻率為15.7%；rs5925位點(diǎn)TT、CT、CC 3種基因型分布頻率分別為61.2%、33.7%和5.1%，等位基因T的頻率為78.1%，等位基因C的頻率為21.9%（表3）。

丙型肝炎人群LDL-R基因rs688位點(diǎn)CC、CT、TT 3種基因型分布頻率分別為76.5%、21.2%和2.2%，而等位基因C的頻率為87.2%，等位基因T的頻率為12.8%；rs5925位點(diǎn)TT、CT、CC 3種基因型分布頻率分別為64.8%、32.4%和2.8%，等位基因T的頻率為81.0%，等位基因C的頻率為19.0%（表3）。

2.4LDL-R基因SNP位點(diǎn)基因型與丙型肝炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

丙型肝炎組rs688和rs5925兩個(gè)位點(diǎn)各基因型分布頻率均與正常對照組無明顯差異（rs688：χ2= 1.52，P＞0.05；rs5925：χ2=0.488，P＞0.05）。rs688位點(diǎn)CC基因型與丙型肝炎發(fā)病之間的聯(lián)系強(qiáng)度為1.35（95%CI：0.839～2.161）；rs5925位點(diǎn)TT基因型與丙型肝炎發(fā)病之間的聯(lián)系強(qiáng)度為1.17（95%CI：0.758～1.792），見表3。

2.5LDL-R基因SNP位點(diǎn)等位基因與丙型肝炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

丙型肝炎組rs688和rs5925兩個(gè)位點(diǎn)等位基因頻率均與正常對照組無明顯差異（均為P＞0.05）。進(jìn)一步分析LDL-R基因多態(tài)性對丙型肝炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響發(fā)現(xiàn)，rs688位點(diǎn)上的C等位基因與丙型肝炎發(fā)病之間的聯(lián)系強(qiáng)度為1.29（95%CI：0.832～1.990）；而rs5925位點(diǎn)上T等位基因與丙型肝炎發(fā)病之間的聯(lián)系強(qiáng)度為1.13（95%CI：0.771～1.643），見表3。

表3 正常對照組與丙型肝炎組LDL?R基因SNP基因型和等位基因頻率的比較Tab.3 Genotype and allele frequencies of the LDL?R SNPs in the HCV?infected and control groups

3 討論

感染HCV后，有約15%～45%的患者可以自限清除病毒，其他則發(fā)展為持續(xù)感染［1］。即使感染同一亞型的病毒，不同個(gè)體的病情輕重與轉(zhuǎn)歸亦存在差異。因此宿主遺傳因素在HCV感染的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用［2，3］。近年來對HCV感染細(xì)胞和機(jī)體的研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染與脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有著密切聯(lián)系［4～9］。LDL-R基因位于人類第19號染色體短臂末端（p13.1～13.3），全長45 kb，編碼860個(gè)氨基酸的受體前體蛋白，由18個(gè)外顯子和17個(gè)內(nèi)含子組成［5～7］。LDL-R是一種細(xì)胞表面糖蛋白，以肝細(xì)胞含量最多。大量研究證實(shí)，LDL-R是HCV及其他黃病毒屬的主要細(xì)胞膜受體［8］。HCV病毒進(jìn)入細(xì)胞的量與LDL-R的表達(dá)相關(guān)，HCV的入胞作用依賴于HCV與LDL-R的相互作用，同時(shí)血清中含HCV RNA的物質(zhì)的密度異質(zhì)性與HCV和低密度脂蛋白（LDL）的結(jié)合有關(guān)。體內(nèi)LDL-R是介導(dǎo)HCV-VLDL/ LDL復(fù)合體胞飲作用的受體，HCV與某種脂蛋白配基結(jié)合形成復(fù)合物后通過LDL-R介導(dǎo)進(jìn)入肝細(xì)胞，其產(chǎn)物與肝細(xì)胞中合成的載脂蛋白相互作用影響脂肪代謝，形成脂肪肝等病理表現(xiàn)［9］。利用LDL-R可能是HCV的受體這一概念，在制作HCV感染體外模型時(shí)用美降脂誘導(dǎo)LDL-R的產(chǎn)生，使得所用細(xì)胞長期釋放HCV達(dá)130 d，所得結(jié)論支持體外LDLR介導(dǎo)HCV進(jìn)入細(xì)胞的假說［8］。

LDL-R的SNP種類比較多，多數(shù)與脂蛋白代謝異常有關(guān)［11］。其中，LDL-R基因上rs688和rs5925為比較值得研究的多態(tài)性位點(diǎn)，近些年，國內(nèi)外已經(jīng)對于這兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了一定的研究。2007年，Haiyan等［12］發(fā)現(xiàn)rs688為位于LDL-R外顯子12（Exon12）上的位點(diǎn)。Gabriella在2009年對中國上海人群中血清血脂水平的基因決定性研究中表明，在該人群中的rs688等位基因攜帶者具有典型的高血清甘油三酯水平［13］。2010年Martinelli［14］在研究中指出，在包括血漿脂類等傳統(tǒng)心血管危險(xiǎn)因素的調(diào)整后，rs688保持對冠狀動(dòng)脈硬化的相關(guān)性。2012年，Lee等［15］在進(jìn)行臺灣地區(qū)的缺血性腦血管病相關(guān)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，LDL-R中rs5925的基因多態(tài)性與腦梗死具有相關(guān)性。2013年研究發(fā)現(xiàn)，rs688、rs5925等位基因與冠狀動(dòng)脈疾病有聯(lián)系，當(dāng)rs688從野生型的TCAACG到多態(tài)型的TCAATG改變，會(huì)使缺血性腦血管病風(fēng)險(xiǎn)增加［16］。目前，LDL-R的SNP是否與HCV有關(guān)，國內(nèi)外的研究尚未完善，因此是一個(gè)值得深入探討的問題。

正常人群中，LDL-R的SNP基因型和等位基因頻率分布如表1所示。rs688位點(diǎn)的主要基因型為CC型，少數(shù)等位基因?yàn)門；rs5925位點(diǎn)主要基因型為TT型，少數(shù)等位基因?yàn)镃，雖然同人群該位點(diǎn)的SNP分布尚未見報(bào)道，但本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與dbSNP數(shù)據(jù)庫中（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP）中國北京漢族人群分布一致。

本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，正常對照組與丙型肝炎組相比，LDL-R上兩個(gè)基因位點(diǎn)rs688和rs5925基因型分布情況以及等位基因分布情況的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，研究結(jié)果提示雖然LDL-R是HCV感染細(xì)胞的重要受體，rs688和rs5925對于血脂水平的升高以及缺血性腦血管病存在一定的影響，并且是相對活躍的位點(diǎn)，但是rs688和rs5925兩個(gè)位點(diǎn)的SNP與丙型肝炎易感性之間并不具有相關(guān)性。鑒于本研究人群局限于中國東北地區(qū)漢族人群，有可能導(dǎo)致該結(jié)果并不適用于其他人群；其次，對于所研究的兩個(gè)位點(diǎn)的SNP是否進(jìn)一步參與了丙型肝炎的發(fā)生發(fā)展等問題，仍需進(jìn)一步研究；同時(shí)，對于在LDL-R基因中的其他位點(diǎn)是否存在影響LDL-R一級結(jié)構(gòu)并與HCV感染有關(guān)的多態(tài)性等都需進(jìn)一步研究

綜上所述，中國東北地區(qū)漢族人群中LDL-R基因rs688和rs5925 SNP與丙型肝炎易感性無相關(guān)性。丙型肝炎是受病毒感染和宿主基因調(diào)控、免疫應(yīng)答等共同作用的復(fù)雜過程，LDL-R基因多態(tài)性影響丙型肝炎發(fā)病的作用機(jī)制及其地域分布特點(diǎn)等仍需進(jìn)一步研究。

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（編輯 裘孝琦）

Correlation Analysis Between LDL-R SNPand Susceptibility to Hepatitis CVirus

ZHANGQing-yang，JIN Dan-ning，JINGuo-jiang，KANG Hui，SHANGHong
（DepartmentofLaboratory Medicine，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the relationship of rs688 C/T and rs5925 C/TofLDL-RSNP to hepatitis C.MethodsHigh resolution melt-polymerase chain reaction（HRM-PCR）method was employed to detect rs688 and rs5925 of theLDL-Rgene in 179 patients infected with HCV and 178 healthy individualsorthese infected with otherdisease exceptHCVas the healthy controlgroup.ResultsThere was no statisticalsignificantdifferences in rs688 and rs5925 ofLDL-Rgene between 179 patients infected with HCV and healthy controls（P＞0.05）.ConclusionThere are rs688 and rs5925 ofLDL-RSNP in Chines population，butitmay notbe involved in the infection ofHCV.

LDL-R；single nucleotide polymorphism；high resolution melt；polymerase chain reaction；hepatitis C

R512.6

A

0258-4646（2014）12-1109-05

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20112104110001）

張青楊（1986-）男，技師，本科.

康輝，E-mail：kanghui65@sina.com

2014-09-19

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