耳鳴大鼠耳蝸基底膜內毛細胞Otoferlin mRNA及蛋白表達的研究

王曉宏，趙久晗，孫永新，徐愛華

（中國醫科大學附屬第一醫院1.神經內科；2.康復科，沈陽110001）

耳鳴大鼠耳蝸基底膜內毛細胞Otoferlin mRNA及蛋白表達的研究

王曉宏1，趙久晗1，孫永新2，徐愛華2

（中國醫科大學附屬第一醫院1.神經內科；2.康復科，沈陽110001）

目的研究耳鳴大鼠耳蝸基底膜內毛細胞耳畸蛋白（Otoferlin）表達的變化，從而推測其在耳鳴的發生中可能的作用機制。方法將24只Wistar大鼠隨機分成空白對照組、生理鹽水組和耳鳴模型組3組，每組8只。通過腹腔注射水楊酸鈉制造耳鳴模型并用飲水抑制法對耳鳴模型進行驗證。造模成功后，運用實時熒光定量RT-PCR方法及Western blot方法檢測Otoferlin的表達情況。結果采用水楊酸鈉注射方法成功建立了大鼠耳鳴模型；與空白對照組相比，生理鹽水組大鼠OtoferlinmRNA和蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），而耳鳴模型組OtoferlinmRNA及蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。結論耳鳴大鼠耳蝸基底膜內毛細胞OtoferlinmRNA及蛋白質合成改變，可能是耳鳴產生的機制之一。

耳鳴；水楊酸鈉；耳畸蛋白；耳蝸基底膜

耳鳴是無外界相應聲源刺激下而被機體感知的一種響聲。根據文獻報道，持續性耳鳴患者約占總人口的10%，其中約有2%～5%的耳鳴人群生活質量嚴重下降［1］。目前，耳鳴發病機制尚不十分清楚，也無有效的治療措施。研究表明，耳蝸內毛細胞帶狀突觸在聲音信號的釋放和傳遞中起關鍵作用［2］。以往對耳鳴機制的研究主要集中在大腦皮層及耳蝸的內、外毛細胞、血管紋、螺旋神經元等部位，但對聲音信息傳遞給中樞神經系統的第一個傳入神經突觸-內毛細胞帶狀突觸，卻一直未給予充分重視。

耳畸蛋白（Otoferlin）是近年來在耳蝸內毛細胞中發現的一種新的蛋白質，分子量約230 kDa，主要功能是促使突觸囊泡與質膜緊密融合并釋放神經遞質，對維持正常聽力起重要作用［3］。動物實驗結果表明，Otoferlin蛋白廣泛分布于大鼠的小腦、海馬、耳蝸、前庭、耳蝸螺旋神經節、前庭神經核和睪丸等組織［4］。目前，關于耳鳴與耳蝸基底膜內毛細胞中Otoferlin的表達之間的關系尚未見報道。

本研究擬通過水楊酸鈉注射誘導并成功建立Wistar大鼠耳鳴模型后，提取耳蝸基底膜，采用實時定量RT-PCR和Western blot的方法檢測耳鳴大鼠模型耳蝸基底膜內毛細胞中Otoferlin的表達情況，從而推測其在耳鳴發生中可能的作用機制，為耳鳴的臨床治療及新藥研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2月齡Wistar大鼠，雌雄不限，體質量200～250 g，由中國醫科大學動物中心提供。兔抗鼠Otoferlin多克隆抗體（美國ABcam公司）；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗鼠二抗（美國SANTA公司）；水楊酸鈉粉劑（國藥集團化學試劑有限公司）；聲級計（香港希碼聲級計AR824，寧波凱諾儀器有限公司）；大鼠操作性條件反射箱系統（寧波安來軟件科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組：選用ABR聽閾正常2月齡Wistar大鼠，排除中耳及內耳疾病，隨機分為耳鳴模型組、生理鹽水對照組和空白對照組3組，每組8只。耳鳴模型組：采用10%水楊酸鈉腹腔注射（350 mg·kg-1，每2 d1次）10～14 d；生理鹽水對照組：在造模相同時間點，腹腔注射相同體積的生理鹽水；空白對照組：將大鼠置于安靜環境中，無飲食限制及藥物注射，無條件反射訓練。

1.2.2 條件反射建立，確立耳鳴動物模型［5，6］：大鼠適應性喂養1周后，禁水1～2 d，使其處于輕度口渴狀態。在本底噪聲＜25分貝聲壓級（deci Bel sound pressure level，dB SPL）隔聲室內的隔音柜里進行實驗操作。分別在3、10、15、20、25 min出現條件刺激背景音（8 Hz 50 dB SPL純音停止，1 min/次）。停止背景音刺激后，如果動物舔水時間持續超過5 s，從飲水嘴處給予電壓為50 V的電刺激，次數不限。通過此種訓練方式，使動物將電擊刺激與噪聲停止條件刺激直接建立聯系，形成“背景音停止-舔水動作停止或減少”的條件反射。以舔水抑制率（R）判斷條件反射是否建立成功。公式為：R=B/（A+B），其中，A為背景音關閉前60 s的舔水時間，B為背景噪聲關閉后60 s的舔水時間。當R值＜0.2時，說明大鼠條件反射建立成功。保持飼養室內燈光12 h開/關，控制室溫22～26℃，濕度30%～60%。成功建立大鼠條件反射后，觀察大鼠條件反射消退期的變化，以舔水率R的變化情況為標準，判斷大鼠是否產生耳鳴。

1.2.3 耳蝸基底膜制備［7］：成功建立耳鳴大鼠模型后，耳鳴模型組在相同時間段繼續腹腔注射水楊酸鈉（每2 d1次），并于注射2 h后用頸椎脫臼法處死大鼠，斷頭后取出顳骨，迅速分離耳蝸，剔除聽小骨，開放圓窗和卵圓窗，在解剖顯微鏡下于PBS液中使用游離絲鑷分離耳蝸基底膜頂回，清除前庭膜、蓋膜及螺旋韌帶，取出全耳蝸基底膜。

1.2.4 實時定量RT-PCR檢測OtoferlinmRNA的表達：采用TRIZOL法提取總RNA，用12～18 oligo（dT）和super scriptⅡ進行逆轉錄，用雙標記熒光探針混合物（SYBR Green PCR Master mix）在ABI prism 7500自動序列分析系統（Biosystems）中進行實時PCR分析，每組重復3次。參考GenBank中大鼠基因序列，設計擴增Otoferlin引物。Otoferlin引物序列（NM_001276720.1）：上游：5′-GATGCGACTTCTG ATGCT-3′；下游：5′-TCCTCTGCCTCC TCTGA-3′，產物長度98 bp。內參照β-actin引物序列（NM_ 001101.3）：上游：5′-TGCGTGACATTAAGGAGAA-3′；下游：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGT-3′，產物長度172 bp。采用2-△△Ct法進行計算，計算公式：（1）改變的倍數=2-△△Ct；（2）ΔΔCT=（實驗組CT目的基因-實驗組CT內參基因）-（對照組CT目的基因-對照組CT內參基因）。

1.2.5 Western blot檢測Otoferlin蛋白表達：將各組耳蝸基底膜放入預冷100 μL細胞裂解液（20 mmol/L Tris-HCl pH7.5，150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，1 mmol/L PMSF，1 μg/mL亮肽素，1 μg/mL抑肽素）超聲粉碎，12 000 r/min離心1 h后取上清。酚試劑法測量各組蛋白含量，每組取總蛋白40 μg上樣，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，50V 2 h將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。使用TTBS洗膜后，將其置入含5%脫脂奶粉的TTBS溶液中4℃封閉過夜。TTBS清洗后，加入1∶800稀釋的兔抗鼠一抗（Otoferlin和β-actin抗體），室溫下孵育2 h。TBS洗膜，加入辣根酶標記山羊抗兔二抗（1∶10 000），室溫下孵育2 h。ECL發光成像，ImageJ圖象分析軟件對印跡條帶進行灰度值分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 耳鳴動物模型的建立

經過訓練，動物成功建立了“背景音停止-舔水動作停止或減少”的條件反射。同時，在條件反射建立后，耳鳴模型組動物消退時間［（1.74±0.67）d］均明顯快于生理鹽水對照組［（4.56±0.81）d］，差異有統計學意義（P＜0.05），說明耳鳴模型組動物全部造模成功。

2.2 各組大鼠耳蝸基底膜細胞中OtoferlinmRNA表達的變化

提取總RNA后，紫外分光光度計測定OD260/280比值約2.0，說明所提取的RNA較純，無蛋白質污染。如圖1所示：空白對照組、生理鹽水對照組和耳鳴模型組OtoferlinmRNA表達水平分別為1.0± 0.01、0.99±0.02和5.86±0.68。與空白對照組相比，生理鹽水對照組的OtoferlinmRNA表達無明顯變化（P＞0.05），而耳鳴模型組表達則顯著升高（P＜0.05）。提示Otoferlin在正常及耳鳴大鼠耳蝸基底膜中均有表達，且耳鳴大鼠表達升高。

圖1 各組大鼠耳蝸基底膜細胞中Otoferlin mRNA的表達情況Fig.1 Otoferlin mRNA expressions in inner hair cells of basilar membrane of rats

2.3 各組大鼠耳蝸基底膜細胞中Otoferlin蛋白表達的變化

采用Western blot方法檢測了各組大鼠耳蝸基底膜細胞中Otoferlin蛋白的表達情況，結果如圖2所示：空白對照組、生理鹽水對照組和耳鳴模型組Otoferlin蛋白相對于內參蛋白β-actin的表達比值分別為0.39±0.12、0.41±0.13和0.75±0.21。Otoferlin蛋白表達變化情況與其mRNA表達情況相似。與空白對照組相比，生理鹽水對照組Otoferlin蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），而耳鳴模型組則顯著升高（P＜0.05）。提示Otoferlin蛋白在各組大鼠耳蝸基底膜細胞中均勻表達，且耳鳴大鼠表達明顯升高。

圖2 各組大鼠耳蝸基底膜細胞中Otoferlin蛋白的表達情況Fig.2 Expressions of Otoferlin protein in inner hair cells of basilar membrane of rats

3 討論

目前，耳鳴發生的機制尚未明了。盡管有許多有關耳鳴的假說，但均未能全面闡述所有的耳鳴現象。Otoferlin是一種具有6個鈣離子結合區域（C2區域）的特殊跨膜蛋白質，由OTOF基因編碼。研究表明，Otoferlin蛋白后4個C2區域由5個完整的天冬氨酸殘基組成，可與鈣離子結合。同時，這些C2區域與其他分子的結合也是鈣離子依賴性［8］。研究證明，C2區域能夠與磷脂或蛋白質（例如，胞漿磷脂酶A2、突觸結合蛋白Ⅰ、Ras相關GTP結合蛋白等）結合，參與神經遞質的釋放，在細胞膜運輸及信號傳導方面具有十分重要的作用。研究顯示Otoferlin蛋白參與鈣離子依賴的突觸囊泡融合及神經遞質的釋放。實驗證明，OTOF基因敲除純合小鼠表現為極重度耳聾，在對小鼠耳蝸切片進行免疫組化染色和膠體金技術標記時發現，小鼠耳蝸內神經細胞中帶狀突觸附近的Otoferlin蛋白約占55%，其中突觸前膜的Otoferlin蛋白約占21%、突觸部位附近胞質中Otoferlin蛋白約占4%［9，10］。而在這些OTOF基因敲除的小鼠中，內毛細胞與傳入神經元所形成的帶型突觸形態無任何異常變化，同時，Ca2+流通也正常，但其突觸囊泡的胞吐功能卻完全喪失。因此，Otoferlin可能是一種融合在內毛細胞帶狀突觸前膜的鈣離子感應器，對內毛細胞傳入突觸囊泡的分泌起十分重要的作用［11］。

目前，雖然關于Otoferlin蛋白的結構、表達和功能的研究已經取得了一定的進展，但是關于Otoferlin蛋白與耳鳴疾病的相互關系尚未見報道。因此，本研究利用水楊酸鈉腹腔注射方法建立了耳鳴大鼠模型，同時研究Otoferlin在耳鳴大鼠模型耳蝸基底膜細胞中的表達情況。本研究中，根據條件反射消退期的變化情況判斷造模動物是否產生耳鳴，如果動物產生耳鳴，則在背景音停止后，動物會把耳鳴當成部分安全的信號，從而加快條件反射的消退。本研究在大鼠建立條件反射后，觀察并對比了大鼠條件反射消退期的變化情況，以攝水抑制率R為評價指標判斷大鼠是否產生耳鳴。結果證明，在成功建立條件反射后注射水楊酸鈉的大鼠產生了耳鳴。當條件刺激背景音出現時，大鼠因耳鳴而無法準確分辨背景音是否停止，因此消退期縮短。耳鳴模型組動物消退時間明顯快于生理鹽水對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05），說明耳鳴模型組動物全部造模成功。

本研究分別用實時定量RT-PCR和Western blot的方法檢測了各組大鼠耳蝸基底膜細胞中Otoferlin表達的變化情況。結果提示，Otoferlin在正常及耳鳴大鼠耳蝸基底膜中均有表達，與空白對照組相比，生理鹽水對照組大鼠OtoferlinmRNA和蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），而耳鳴模型組OtoferlinmRNA和蛋白表達則顯著升高（P＜0.05）。提示在水楊酸鈉注射誘導的大鼠耳鳴動物模型中Otoferlin表達出現了異常。結合以往對Otoferlin蛋白生理功能的研究結果，推測Otoferlin蛋白的功能異常可能是水楊酸鈉誘導大鼠耳鳴的原因之一。Otoferlin蛋白與耳鳴疾病之間的關系仍有待于進一步深入研究。

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（編輯 王又冬）

Expression of Otoferlin in the Inner Hair CellsofBasilar Membrane in the RatModelof Tinnitus

WANGXiao-hong1，ZHAO Jiu-han1，SUNYong-xin2，XU Ai-hua2
（1.DepartmentofNeurology，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China；2.DepartmentofRehabilitation，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the expression of Otoferlin in the inner hair cells of basilar membrane in a rat model of tinnitus for their potential roles in tinnitus pathogenesis.MethodsTwenty fourWistarrats were randomly divided into three groups（n=8）：group received salicylate as tinnitus models，group treated with normal saline，and the untreated controls.Tinnitus modeling was verified through drinking inhibition following intraperitoneal administration of salicylate.Expression of Otoferlin was examined by real-time RT-PCR and Western blot assays.ResultsTinnitus rat models were successfully established by the intraperitoneal administration of salicylate.Compared with the untreated controls，there were no significant differences of Otoferlin expressions in the normal saline group，at neither mRNA nor protein levels（P＞0.05）；Otoferlin expressions in tinnitus models group was higher than that in the untreated controls（P＜0.05）.ConclusionThe expressions of Otoferlin was increased in the inner hair cells ofbasilarmembrane ofratswith tinnitus，which mightbe a mechanism fortinnitus.

tinnitus；salicylate；Otoferlin；basilar membrane

R764.45

A

0258-4646（2014）12-1114-03