5味中藥對體外培養原代人外陰皮膚成纖維細胞增殖的影響

于爽，武昕，姜英，趙向宇

（中國醫科大學1.附屬第一醫院中心實驗室；2.附屬第一醫院婦科；3.基礎醫學院生物化學與分子生物學研究室，沈陽110001）

·論著·

5味中藥對體外培養原代人外陰皮膚成纖維細胞增殖的影響

于爽1，武昕2，姜英2，趙向宇3

（中國醫科大學1.附屬第一醫院中心實驗室；2.附屬第一醫院婦科；3.基礎醫學院生物化學與分子生物學研究室，沈陽110001）

目的利用原代培養的人外陰正常皮膚成纖維細胞，觀察中藥對人外陰皮膚成纖維細胞增殖的影響。方法胰蛋白酶消化、分離及培養人外陰皮膚成纖維細胞；倒置顯微鏡下觀察成纖維細胞生長狀態；HE染色觀察細胞爬片下的形態及著色；免疫組織化學染色觀察成纖維細胞中間絲波形蛋白；測定細胞生長曲線；MTT法測定莪術、黃芪、丹參、川穹及當歸5種中藥作用后細胞增殖能力。結果生長曲線測定結果顯示：傳6代內以及傳6代內復蘇人外陰皮膚成纖維細胞增殖能力均很強。MTT檢測結果顯示：5種藥物在特定濃度范圍內均能抑制人外陰皮膚成纖維細胞的增殖。分別作用于人外陰皮膚成纖維細胞72 h后，莪術5、10、100 mg/L濃度組，黃芪500、1 000 mg/L濃度組，丹參1 000 mg/L濃度組，川穹500、1 000 mg/L濃度組，當歸100、500、1 000 mg/L濃度組均顯示抑制增殖作用，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），其中莪術和川穹的抑制強度呈劑量依賴性。結論成功建立了體外人外陰皮膚成纖維細胞原代培養及鑒定方法；特定濃度范圍內的莪術、黃芪、丹參、川穹和當歸能夠抑制人外陰皮膚成纖維細胞的體外增殖。

成纖維細胞；細胞增殖；中藥

人皮膚成纖維細胞具有較強的自我更新能力，是皮膚損傷后的主要修復細胞［1］?；盍υ鰪姷娜似つw成纖維細胞可以引起皮膚的硬化［2］，成纖維細胞分泌膠原蛋白的異常與外陰硬化性苔蘚的病變形成有關。目前，中藥治療外陰硬化性苔蘚雖然有一定的效果，但療效不確切，藥物作用的分子機制尚不清楚。因此，本研究擬探討中藥對外陰皮膚成纖維細胞的增殖的影響，旨在研究中藥是否能逆轉外陰硬化性苔蘚的病變，為該病的中藥治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本：外陰正常皮膚2塊，來源于中國醫科大學附屬第一醫院婦科行外陰整形術切除的皮膚組織，切除后迅速進行處理。

1.1.2 試劑：四甲基偶氮唑藍（MTT）購于Sigma公司；二型膠原酶購于Invitrogen公司；波形蛋白抗體購于BioGenex公司；即用型SABC試劑盒購于BOSTER公司；中藥莪術、黃芪、丹參、川穹、當歸購自中藥店。

1.2 方法

1.2.1 原代細胞培養：外陰正常皮膚2塊，每塊2 cm×3 cm，用含抗生素的PBS反復漂洗去除脂肪。將漂洗后的外陰皮膚組織剪成0.5 cm×1.5 cm大小的條形，置于含2 mg/mLⅡ型膠原酶消化液的離心管中，4℃過夜。次日，用無菌剪刀和鑷子分離表皮與真皮，棄表皮，留真皮，使用0.25%的胰蛋白酶反復吹打消化，用含血清的DMEM/F12培養基清洗，1 200 r/min離心8 min，棄上清，按1×105/mL細胞濃度用10%牛血清的DMEM/F12培養液培養。待細胞貼壁，觀察細胞生長情況并進行傳代和換液。

1.2.2 倒置顯微鏡下觀察細胞形態：培養48 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞，記錄照相。

1.2.3 HE染色：收集培養到第3代的成纖維細胞，以2×105/mL的密度行細胞爬片。培養24 h后使用PBS充分漂洗，進行常規HE染色，中性樹膠封片。

1.2.4 免疫組織化學染色檢測波形蛋白：將分離得到的原代人外陰皮膚成纖維細胞以2×105/mL的密度進行爬片培養。待細胞爬至玻片40%～60%時，取出玻片，PBS漂洗。4﹪多聚甲醛處理20 min，PBS漂洗，血清封閉，滴加即用型鼠抗人波形蛋白一抗，4℃過夜。PBS漂洗后滴加山羊抗小鼠IgG二抗37℃孵育20 min；滴加SABC試劑37℃孵育20 min；DAB顯色30 s，蘇木素復染，顯微鏡觀察。

1.2.5 測定細胞生長曲線：分別將培養第2代和第6代的人外陰皮膚成纖維細胞消化，調節細胞濃度至2×104/mL，按每孔1 mL接種到24孔培養板進行培養，每隔24 h收集3孔細胞，分別計數求均值，連續記錄7 d后，繪制細胞生長曲線。

1.2.6 測定凍存細胞生長曲線：將培養第2代和第6代的成纖維細胞常規凍存于液氮。4周后復蘇，調節細胞濃度2×104/mL，按每孔1 mL接種到24孔培養板進行培養。每隔24 h收集3孔細胞，分別計數求均值，連續記錄7 d后，繪制細胞生長曲線。

1.2.7 實驗藥物的制備：將中藥莪術、黃芪、丹參、川穹和當歸分別加6倍量水煎2次，每次2 h。雙層紗布過濾并合并藥液，濃縮后使用95%乙醇等體積沉淀，取上清，旋轉蒸發回收乙醇，活性炭脫色3次，濾器過濾除菌后調節pH至7.0。根據生藥的質量和最終藥物提取液的體積計算藥液濃度（g/mL），作用于細胞培養時均用無血清培養基稀釋到相應終濃度（5、10、100、500、1 000 mg/L）。

1.2.8 細胞增殖抑制率的檢測（MTT法）：取對數生長期細胞胰酶消化并將細胞濃度稀釋為2×104/mL，每孔加100 μL細胞懸液接種于96孔培養板中，5% CO2、37℃培養箱中培養24 h后，更換為100 μL無血清培養基繼續培養24 h。每孔加入100 μL含不同濃度藥物的培養基稀釋液，培養72 h后，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT，孵育4 h。將液體吸出后每孔加入100 μL二甲基亞砜，振蕩混勻，酶聯免疫檢測儀于492 nm處比色，結果以A值表示，并計算細胞增殖率（proliferation rate，PR）=A/A0× 100%，每孔至少重復6次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 倒置顯微鏡下人外陰皮膚成纖維細胞的形態（圖1）

原代培養的人外陰皮膚成纖維細胞約在培養3～5 d時進入對數生長期。鏡下觀察細胞大多呈長梭形。細胞生長旺盛時在倒置顯微鏡下排列成簇狀。

2.2 HE染色細胞形態學觀察（圖2）

圖1 倒置顯微鏡下成纖維細胞的形態×20Fig.1 Morphology of fibroblasts observed under inverted microscope×20

圖2 人外陰皮膚成纖維細胞HE染色×20Fig.2 HE staining of human vulvar skin fibroblasts×20

HE染色后，人外陰皮膚成纖維細胞在光鏡下呈多角形和長梭形，細胞核較大，圓形或橢圓形，并呈現淡藍色。

2.3 免疫組織化學法檢測波形蛋白（圖3）

波形蛋白免疫組化染色顯示：原代人外陰皮膚成纖維細胞胞質著染，呈棕黃色。

圖3 人外陰皮膚成纖維細胞波形蛋白免疫組織化學染色×20Fig.3 Immunohistochemical staining of vimentin in human vulvar skin fibroblasts×20

2.4 生長曲線測定結果（圖4）

生長曲線顯示：原代人外陰皮膚成纖維細胞的倍增時間較短，在特定時間段內細胞數量與培養時間呈正相關；傳代后的成纖維細胞與原代細胞比較，具有同樣的增殖能力，原代培養第2及第6代細胞的增殖能力與凍存復蘇后的同代次細胞比較，無明顯差異。結果顯示：由于復蘇成活率的影響，凍存復蘇后的成纖維細胞潛伏期內有負增殖，但在第2～3天又表現出較強的增殖能力。

圖4 人外陰皮膚成纖維細胞生長曲線Fig.4 Growth curve of human vulvar skin fibroblasts

2.5 MTT檢測結果

如表1所示：莪術在低濃度組（5、10 mg/L）和中濃度組（100 mg/L），黃芪在高濃度組（500、1 000 mg/L），丹參在高濃度組（1 000 mg/L），川穹在高濃度組（500、1 000 mg/L），當歸在中濃度組（100 mg/L）和高濃度組（500、1 000 mg/L）可以抑制人外陰皮膚成纖維細胞的增殖，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。莪術和川穹的抑制作用呈劑量依賴性。黃芪在低濃度組（10 mg/L）和中濃度組（100 mg/L），當歸在低濃度組（5、10 mg/L）顯示促進增殖作用，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），此2種藥物的促增殖作用均呈現劑量依賴性；其他受試組濃度對人外陰皮膚成纖維細胞的增殖無影響。

3 討論

人皮膚成纖維細胞具有較強的自我更新能力，作為皮膚衰老和細胞受損后的主要修復細胞，能夠產生大量的膠原蛋白、彈性纖維蛋白及多種細胞修復因子，從而發揮作用。研究表明，永生化的人皮膚成纖維細胞可以作為自體細胞基因治療的可靠靶細胞［3］。人體腹部皮膚、包皮組織以及動物皮膚的成纖維細胞體外分離、原代培養已有相關研究［4～6］，然而人外陰皮膚成纖維細胞的分離、原代培養及鑒定尚未見報道。成纖維細胞具有穩定的生物學特性，包括細胞形態、標志蛋白等。成纖維細胞大多呈大多角形和扁平星形，波形蛋白作為成纖維細胞的一種標志蛋白［7］，不同于肌細胞的橋連蛋白，也不同于上皮細胞的角蛋白，是鑒定成纖維細胞的特異標志。

表1 5種中藥對原代人外陰皮膚成纖維細胞增殖的影響Tab.1 Effects of five herbs on the proliferation of primary human vulvar skin fibroblasts

本研究采用胰蛋白酶和膠原酶聯合消化法體外分離培養人外陰皮膚成纖維細胞，通過生長曲線的測定以及生物學特性的驗證確定成纖維細胞體外分離培養成功。生長曲線顯示：分離得到的成纖維細胞在體外經過潛伏期、細胞增殖、對數生長以及平臺期。傳代后的成纖維細胞顯示出與原代細胞基本相同的增殖能力。雖然凍存復蘇后的細胞在潛伏期內與未凍存細胞比較略呈現負增殖，但是在有限的傳代次數內仍顯示較強的增殖力。

莪術為姜科植物莪術和溫郁金的根莖，研究表明莪術能夠抑制腫瘤細胞、晶狀體上皮細胞以及人胚肺成纖維細胞的增殖［8～10］。因其具有行氣破血、消積止痛的功效，我國民間用莪術治療腫瘤具有悠久的歷史。本研究通過MTT法檢測了莪術對人外陰皮膚成纖維細胞增殖的影響，結果顯示：5、10、100 mg/L濃度組莪術具有抑制細胞增殖的作用，且在此濃度范圍內抑制強度與藥物濃度呈現劑量依賴性；高濃度組（500、1 000 mg/L）莪術對人外陰皮膚成纖維細胞無明顯影響，與對照組比較無明顯差異。研究證實，莪術對晶狀體上皮細胞的抑制作用可能與細胞內游離Ca2+濃度升高有關，其作用通過介導的Ca2+-PKC信號通路實現［9］，提示莪術抑制人外陰皮膚成纖維細胞增殖的作用機制可能也與此有關。

中藥丹參和川芎具有活血化瘀的功效，研究證實其不僅能抑制成纖維細胞的增殖［11］，還可以抑制成纖維細胞合成膠原［12］，發揮抗纖維化作用。本研究結果表明，低濃度組的丹參和川穹對體外建立的人外陰皮膚成纖維細胞的增殖沒有明顯影響，其中丹參僅在最高濃度（1 000 mg/L）時具有抑制作用；川穹則在500、1 000 mg/L濃度顯示出劑量依賴性抑制作用。然而丹參和川穹的抗纖維化以及抑制成纖維細胞增殖的作用機制尚不清楚，可能與抑制促纖維化因子以及激活細胞外基質若干降解酶的活性等有關［13］。

黃芪多糖和當歸揮發油作為中藥黃芪和當歸的主要有效成分，分別具有益氣生肌和活血化瘀等功效。研究表明，黃芪多糖和當歸揮發油可以影響不同組織成纖維細胞的增殖、代謝以及大分子化合物的合成［14，15］。本研究結果表明，高濃度組的黃芪（500、1 000 mg/L）和中高濃度組當歸（100、500、1 000 mg/L）可抑制人外陰皮膚成纖維細胞增殖，低中濃度組的黃芪（5、10、100 mg/L）和低濃度組的當歸（5、10 mg/L）可促進人外陰皮膚成纖維細胞的增殖。

綜上所述，本研究首次成功分離培養了人正常外陰皮膚成纖維細胞，建立了一種穩定、快速高效的成纖維細胞的分離培養體系，對于后續以永生化的人外陰皮膚成纖維細胞作為靶細胞的研究具有重要意義。并且探討了不同濃度5種常見中藥對此正常外陰皮膚成纖維細胞增殖的影響，對于皮膚成纖維細胞的異常增殖以及相關疾病的治療具有一定的臨床指導意義。

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（編輯 王又冬）

EffectsofFive Herbson the invitro Proliferation ofPrimary Human Vulvar Skin Fibroblasts

YUShuang1，WUXin2，JIANGYing2，ZHAOXiang-yu3
（1.Central Laboratory，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Gynecology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Department of Biochemistry and Molecular Biology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo establish a method for culturing of primary human vulva skin fibroblasts，assess the effects of several Chinese herbs including Rhizoma zedoariaeon，Astragalus membranaceus，Salvia miltiorrhiza，Szechwan lovage rhizome and Angelica sinensis on theinvitroproliferation of primary human vulva skin fibroblasts and preliminarily explore the mechanism for the treatment of lichen sclerosus et atrophicus.MethodsHuman vulva skin fibroblasts were cultured aftertrypsin digestion.The morphology ofthe fibroblasts was observed underinverted and electron microscope，also by HE staining.Immunohistochemical staining was performed to observe the vimentin in fibroblasts.The proliferation of fibroblasts was determined by growth curve and MTT assay.ResultsPrimary human vulva skin fibroblasts were obtained and cultured after trypsin digestion.The morphology and biologicalcharacteristics ofthis obtained fibroblastswere verified by inverted and electron microscope observation and HE，immunohistochemical staining.The proliferative ability of the fibroblasts was high within 6 passages after cryopreservation.All of the Chinese herbs could inhibit the proliferation of the obtained fibroblasts at appropriate concentrations.After cultured in medium with different drugs for 72 h，Rhizoma zedoariaeon at the concentration 5，10，100 mg/L，Astragalus membranaceus at the concentration 500，1 000 mg/L，Salvia miltiorrhiza at the concentration 1 000 mg/L，Szechwan lovage rhizome at the concentration 500，1 000 mg/L and Angelica sinensis at the concentration 100，500，1 000 mg/L showed a inhibition effect on the proliferation of fibroblasts，along with significant differences compared with controls.In addition，the effect of Rhizoma zedoariaeon and Szechwan lovage rhizome present a dose-dependent manner.ConclusionThe method forin vitroculture of primary human vulva skin fibroblasts is successfully established.Rhizoma zedoariaeo，Astragalus membranaceus，Salvia miltiorrhiza，Szechwan lovage rhizome and Angelica sinensiscan inhibitthe proliferation ofthe obtained fibroblasts atappropriate concentrations.

fibroblast；cell proliferation；traditional Chinese medicine

R285.5

A

0258-4646（2014）10-0865-05

國家自然科學基金（30973190）

于爽（1984-），女，技師，本科.

武昕，E-mail：xinwu.1964@aliyun.com

2014-06-03

網絡出版時間：