帕金森病患者共核蛋白基因復制子的調查及血清共核蛋白表達水平的研究

李培，羅曉光，李馮銳，3，姜恩珠，景晨晨，任艷，龐灝

（1.中國醫科大學法醫學院血清學教研室，沈陽110001；2.中國醫科大學附屬第一醫院神經內科，沈陽110001；3.包頭醫學院法醫學系，內蒙古包頭014060）

帕金森病患者共核蛋白基因復制子的調查及血清共核蛋白表達水平的研究

李培1，羅曉光2，李馮銳1，3，姜恩珠1，景晨晨1，任艷2，龐灝1

（1.中國醫科大學法醫學院血清學教研室，沈陽110001；2.中國醫科大學附屬第一醫院神經內科，沈陽110001；3.包頭醫學院法醫學系，內蒙古包頭014060）

帕金森病（PD）的發病機制與遺傳因素密切相關，調查形成中腦黒質多巴胺能神經元內病理性路易小體（LB）的主要成分α-共核蛋白的基因（SNCA）在散發PD患者的突變；同時了解α-共核蛋白在血液中的濃度。方法抽取210名散發性PD患者和80名正常人的靜脈血，分離血清后，分別提取RNA和基因組DNA；采用實時定量PCR方法分析SNCA基因的劑量變化以及mRNA表達的水平；應用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中α-共核蛋白的表達水平。結果SNCA基因外顯子1基因組水平相對定量結果顯示，1個散發PD患者比值為1.6，其余PD患者和正常個體的比值在0.8～1.2之間；基因組水平比值增加的PD患者mRNA表達水平與其他PD患者及正常個體比較顯著增加（P＜0.05）；但該患者血清中α-共核蛋白表達水平與其他PD患者及正常個體之間差別沒有統計學意義（P＞0.05）。結論漢族散發PD患者中存在SNCA基因雙拷貝復制，但出現頻率極低；血清中α-共核蛋白的檢測目前不能視為PD分析的有效生物學指標。

帕金森病；α-共核蛋白；SNCA；復制突變

帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是中老年人群中除阿爾茲海默病外最常見的神經系統退行性疾病，在65歲以上的人群中發病率約為1%［1，2］，其臨床特點有靜止性震顫、肌肉強直、運動遲緩和姿勢步態異常等。病理特征主要是中腦黑質致密部多巴胺能神經元進行性變性丟失，紋狀體區多巴胺含量減少，以及殘存的多巴胺能神經元內出現以α-共核蛋白為主要成分的嗜酸性包涵體——路易小體（Lewy body，LB）［3～5］。迄今為止，PD的病因和發病機制仍未完全明確，但隨著PD相關易感基因的發現，遺傳作為重要因素在PD的發病機制中的作用越來越受到重視。目前已經發現至少18個“PARK”位點，其中的α-共核蛋白基因（SNCA，也稱為PARK1/ PARK4），是最早鑒定出的與PD相關的基因。該基因與常染色體顯性遺傳家族性PD相關，A53T、A30P和E46K是發現在少數西方PD患者中的3個編碼區錯義突變；此外，也有研究報道了SNCA基因的復制可導致PD。然而，在我國至今未發現任何SNCA基因編碼區的突變，相關的SNCA基因的復制研究也尚未見報導。

為探討SCNA基因突變與中國漢族人群散發性PD的關系，本研究采用實時定量PCR的方法，對散發性PD患者中是否存在SNCA外顯子的復制突變進行調查，同時應用ELISA方法檢測了α-共核蛋白在PD患者血清中的表達水平以及外周血白細胞中mRNA表達水平，明確血清中α-共核蛋白濃度及mRNA水平是否可以作為PD診斷及病情判斷的生物學標記。

1 材料與方法

1.1 研究對象

210例散發性PD患者均選自中國醫科大學附屬第一醫院神經內科，漢族，PD患者的臨床診斷依據英國帕金森病協會腦庫標準。其中男109例，女101例，患者年齡（62.59±10.72）歲。正常對照組為80例與患者年齡和性別相匹配的無血緣關系正常體檢者，其中男48例，女32例。正常對照組與散發性PD患病組在性別和年齡方面無統計學差異（P＞0.05），均知情并獲得同意。

1.2 基因組水平實時定量分析

抽取210例散發性PD患者和80例正常對照者的肘靜脈血各5 mL，枸櫞酸鈉抗凝，分離白細胞后，部分保存于-80℃備用；部分采用常規酚-氯仿法抽提基因組DNA。

實時熒光定量PCR方法檢測SNCA基因的復制。本研究選擇基因組水平對SNCA基因的外顯子1進行實時定量分析，同時選擇β-2-微球蛋白基因（B2M）為內參基因，所用引物序列分別為：SNCAexon 1上游5′-AGGACGGCGACGACCAGA-3′；exon 1下游5′-AGGACGCTCTCGGAGGGG-3′；B2M上游5′-TCACGTCATCCAGCAGAGAATG-3′；B2M下游5′-CAGTGGGGGTGAATTCAGTGTAG-3′。PCR反應體系總體積為20 μL，其中包括SYBR?Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）（TaKaRa Cat. #RR820A）10 μL，ROX Reference Dye II（50×）（Ta-KaRa Cat.#RR820A）0.4 μL，上游引物和下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，基因組DNA模板濃度均稀釋到7 ng/μL后，每個體系內加2 μL。按照兩步法PCR擴增標準程序，第一步預變性：95℃30 s；第二步PCR反應：95℃5 s，65℃34 s，循環40次；第三步解離階段：95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s。擴增產物用7 500實時定量PCR系統（AB applied biosystems）進行分析檢測。SNCA基因外顯子1的峰值分別與內參比較，Livak方法，即2-△△Ct法，進行數據分析處理。無復制的正常個體的比值范圍為0.8～1.2；比值范圍為1.3～1.7與1.8～2.2可考慮為SNCA基因的二倍復制或三倍復制突變。

1.3 RNA水平實時定量分析

采用RNAisoTMplus試劑盒從先前保存的白細胞中提取RNA，Primer ScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR037S）反轉錄得到SNCA基因的cDNA。參照上述基因組DNA實時定量分析方法進行cDNA實時定量PCR檢測。同樣選取B2M基因作為內參。2-△△Ct方法進行數據分析處理。

1.4 酶聯免疫吸附反應（ELISA）

測定樣本血清蛋白濃度后，向96孔板中分別加入濃度為1，10，20，40，80，100 μg/μL的患者血清樣本100 μL，4℃孵育過夜；PBST洗滌后，加入PBST/ 0.2%BSA稀釋的α-共核蛋白抗體，抗體濃度分別為1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，4℃孵育過夜；PBST/ 0.2%BSA洗滌后，向每孔中加入100 μL辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育60 min；洗滌后向每孔各加100 μL TMB顯色試劑，室溫孵育30 min后，在波長為370 nm處測定吸光值。

1.5 統計學分析

應用SPSS 13.0和Excel 2003統計軟件進行相關數據處理以及統計分析。組間的差異應用χ2檢驗及t檢驗。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1SNCA外顯子1基因組水平復制的分析

采用相對定量PCR方法（圖1、圖2）進行基因組水平的SNCA基因外顯子1及內參基因B2M的定量分析，經2-△△Ct方法進行數據分析后所得到的結果如圖3所示。結果顯示本研究僅發現1例PD患者（PD137）的比值為1.6，其余被檢測樣本的比值在0.8～1.2之間。這樣，從遺傳學角度上提示，SNCA基因的基因組水平復制罕見。

圖3 基因組水平實時定量分析Fig.3 Quantitative real?time PCR in genomic DNA level

2.2SNCAmRNA表達水平分析

為了驗證基因組DNA水平定量分析的結果，我們選擇了3個PD樣本（PD1、PD2、PD137；PD1和PD2是熒光定量在正常范圍的PD患者）和3個正常對照樣本外周血分離的白細胞，提取其RNA，并檢測了SNCAmRNA表達水平。定量分析結果發現PD137的SNCAmRNA表達水平（40.343 0）與另2個PD個體（PD1為2.081 3，PD2為2.378 1，均值為2.229 7）及正常對照（1.0）的SNCAmRNA表達水平比較存在統計學差異（P＜0.05），結果提示DNA水平的定量與mRNA水平定量相符合。

2.3 PD患者血清α-共核蛋白的表達水平

采用ELISA法分別在不同血清濃度和不同抗體濃度的條件下對PD1和PD2患者（熒光定量在正常范圍，P0組）、PD137患者（PD137組）和3個正常個體（對照組）的血清中α-共核蛋白表達水平進行了檢測。結果顯示，PD患者血清中α-共核蛋白表達水平與正常對照比較沒有明顯變化（P＞0.05）。見表1、表2。

表1 PD和正常對照患者不同血清濃度α?共核蛋白表達水平Tab.1 Expression level of α?synuclein in serum different concentration in PD patients and normal controls

表2 PD和正常對照組不同抗體濃度血清中α?共核蛋白表達水平Tab.1 Expression level of α?synuclein in serum in PD patients and normal controls（different concentration of antibody）

3 討論

SNCA（MIM#163890）基因位于人類染色體4q22.1，包含6個外顯子，編碼140個氨基酸組成的蛋白質。1997年，Polymeropoulos等學者［6］在1個意大利人和3個希臘人起源的常染色體顯性遺傳PD家系中首次發現了致病的SNCA基因編碼區中的突變A53T，這也是第1個證明的與PD發病具有直接關聯的致病遺傳位點。這一結果也直接導致了PD研究中的劃時代發現，即SNCA基因產物與形成PD黑質紋狀體病理學上特征性路易小體密切相關。這樣，為了進一步調查PD人群中SNCA基因變異的作用，1998年，Krüger等［7］對192例散發PD患者和7例有PD家系病史患者的SNCA基因所有編碼外顯子進行了詳細的突變分析，又鑒定出了1個新的SNCA基因編碼區突變A30P。然而，隨后基于大量的群體學進行的研究SNCA基因的錯義突變并不常見。最新的PD數據庫網站［8］公布的結果顯示，加上新鑒定的E46K和H50Q，也僅僅在表現出顯性PD特征的群體中發現了4種不同的SNCA基因錯義突變，而且發生頻率極低。與錯義突變比較，SNCA基因的拷貝數變異似乎在PD群體中發現的種類更多，研究的也較為廣泛。自從Singleton等［9］在1個PD的家系中首先觀察到了野生型SNCA基因在基因組范圍內存在復制現象后，包括完整SNCA基因的缺失、雙重和三重復制在不同的種族和地區均有報導。研究發現存在劑量差異的SNCA基因在基因組中的構成大小是不一致的，這一結果提示SNCA基因的拷貝數變異發生于不同的獨立突變事件。來自亞洲群體的研究數據顯示，日本和韓國PD家系和散發的PD均鑒定出SNCA基因的復制，進一步驗證了SNCA基因復制導致了相應的功能增益，同時也提示SNCA基因復制也可能是亞洲群體中散發PD的一種遺傳因素［10～12］。因此，本研究選擇漢族群體進行了SNCA基因復制的調查，在210名散發PD患者中發現1例SNCA外顯子1呈現雙重復制劑量改變，頻率約為0.48%，研究結果表明在中國PD患者中也存在SNCA基因復制現象，出現率與以前亞洲群體中的報導相似，進一步的全國范圍內大樣本調查將會驗證本研究結果，同時也將為SNCA基因復制在中國PD患者中的分布及類型的確定提供有力的支持。

選擇強有力的方法從基因組水平確定SNCA基因復制是1個關鍵點。最初鑒定的三重復制首先選擇了基因組DNA實時定量PCR技術，同時結合測量SNCA基因側翼遺傳標記是否遵循孟德爾遺傳規律［13］以及相應的劑量效應，然后對疑似存在拷貝數變異的樣本進行熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）確證；或者輔以比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH），再借助圖像分析技術對染色體拷貝數量的變化進行定量。之后的研究也有選擇SNP芯片、單倍型分析及PCR步移（PCR walking）等策略對SNCA基因復制進行分子水平定性［14］。隨著實時定量PCR技術的成熟和廣泛應用，眾多的學者們首先偏愛采用半定量PCR方法，從基因組水平對家族性和散發性PD是否存在SNCA基因復制進行調查，研究中選擇不同的SNCA外顯子和內參序列進行擴增和劑量分析［15，16］，對不同的種族和地區PD群體存在的SNCA拷貝數變異進行了良好的評估。因此，本研究依據SNCA外顯子1的半定量分析，參照與內參基因的相對定量，發現了1個拷貝數增加的PD個體。本研究也從mRNA水平上觀察了該個體SNCA的表達變化，借助實時定量分析，顯示出SNCAmRNA表達水平增加。這樣，本研究支持從基因組水平進行SNCA基因復制的分析；同時，研究結果表明從血中進行SNCA基因拷貝數變異的mRNA表達水平分析，在沒有陽性對照及CGH等技術做進一步驗證的前提下，可以對基因組水平結果起到輔助支持作用。

從血液中選擇合適的生物標記進行PD等疾病的診斷、治療和預后評估等具有重要的意義，特別是了解α-共核蛋白在PD患者血中的濃度更加凸顯其價值。眾多的研究發現家族性PD患者表型的嚴重程度取決于SNCA基因的拷貝數及α-共核蛋白水平［13，17，18］。與PD患者的中腦主要病理改變比較，即病理性多巴胺能神經元中存在大量的由α-共核蛋白構成的路易小體，血液中的細胞具有不同的表達譜。已有研究發現，人類外周血液中的單核細胞和血小板等細胞中存在α-共核蛋白的表達［19，20］，并且相關的研究還發現α-共核蛋白可以分泌到血漿中［21，22］。因此，本研究采用ELISA方法，分別在不同血清濃度（1，10，20，40，80，100 μg/μL）和不同抗體濃度（1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600）的條件下檢測PD患者及正常人群血清中的α-共核蛋白水平，結果顯示PD患者血清中α-共核蛋白表達水平與正常對照比較沒有明顯變化（P＞0.05）。這可能說明檢查方法的靈敏度或抗體的特異性及滴度需要在接續的研究中加以驗證和考慮；同時，也可能說明血液中的α-共核蛋白濃度的檢測目前還不能作為PD分析的生物標記。

總體來說，SNCA基因突變頻率較低，其中的SNCA基因的復制目前研究顯示也約占PD遺傳因素的2%，且在不同人群中可能存在種族差異。我們在國內首次應用相對定量PCR的方法對中國漢族人群散發性PD患者進行SNCA基因分析，盡管SNCA基因拷貝數變異在中國漢族人群中罕見，但是為常染色體顯性遺傳特征的SNCA基因突變在PD人群中的研究提供了重要的數據。

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（編輯 武玉欣）

Screening ofα-synuclein Gene Duplication in Patientswith Parkinson′s Disease and Determination of α-synuclein Expression Levelin Serum

LIPei1，LUOXiao-guang2，LIFeng-rui1，3，JIANG En-zhu1，JINGChen-chen1，REN Yan2，PANGHao1
（1.Department of Forensic Serology，School of Forensic Medicine，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Neurology，The First Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China；3.DepartmentofForensic Medicine，Baotou MedicalCollege，Baotou 014060，China）

ObjectiveThe etiology of Parkinson′s disease（PD）is closely related to genetic factor.To explore the α-synuclein gene（SNCA）duplication，which composes the constituents of Lewy body（LB）in dopaminergic neurons of mesencephalon，in sporadic PD patients and controls，and evaluate the α-synuclein′s concentration in serum.MethodsVenous blood samples were collected from 210 PD patients and 80 normal controls inhabited in north China.Genomic DNA，as well as RNA from several individuals，was respectively extracted.The dosage change ofSNCAgene in both genomic DNA level and mRNA expression level was determined by quantitative real-time PCR.The α-synuclein′s concentration in serum was measured by enzyme-linked immunosorbentassay（ELISA）.ResultsWe found thata relatively quantitative ratio ofexon 1 ofSNCAgene to reference gene in a PD patientwas above 1.6.The ratio in the remained PD individuals and controls were between 0.8 and 1.2.The mRNAexpression level ofSNCAin the PD patient was also significantly increased compared with other PD patients and controls.While no obvious vibrations was observed oftheα-synuclein protein expression levelin blood serum in allPD patientsand normalcontrols.ConclusionTheSNCAgene duplication rarely exists in sporadic PD patient inhabited in north China.The measurement of α-synuclein protein in serum may not be an effective biomarker concerning with PD so far.

Parkinson′s disease；α-synuclein；SNCA；gene duplication

R741

A

0258-4646（2014）10-0874-05

國家自然科學基金（81172713）

李培（1987-），女，碩士研究生.

龐灝，E-mail：panghao@mail.cmu.edu.cn

2014-07-11

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