3?氨基苯甲酰胺減輕骨骼肌缺血再灌注損傷的實驗研究

田保玲，李奇，紀(jì)蓮，劉曉梅，楊向紅

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科，沈陽110004；2.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院手外三科，沈陽110024）

3?氨基苯甲酰胺減輕骨骼肌缺血再灌注損傷的實驗研究

田保玲1，李奇2，紀(jì)蓮1，劉曉梅1，楊向紅1

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科，沈陽110004；2.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院手外三科，沈陽110024）

目的研究3-氨基苯甲酰胺（3AB）對鼠骨骼肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，以及組織中凋亡和脹亡的存在情況。方法54只SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、缺血再灌注組、3AB組，持續(xù)缺血4 h，再灌注6、24和48 h。檢測血漿乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸磷酸激酶（CPK）活性，肌肉內(nèi)丙二醛（MDA）含量、總超氧化物歧化酶（SOD）活性，進(jìn)行組織學(xué)、免疫組化、超微結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果3AB組在再灌注24 h和48 h時，在MDA含量下降、SOD活性升高、骨骼肌濕重與干重比值下降、組織學(xué)改變范圍及免疫組化陽性范圍方面，均與缺血再灌注組有明顯差異。結(jié)論再灌注開始時應(yīng)用3AB對于缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用，主要體現(xiàn)在再灌注的稍后期階段（再灌注24 h和48 h）。缺血再灌注過程中，凋亡和脹亡是并存的。

缺血再灌注損傷；3-氨基苯甲酰胺；骨骼肌

臨床上各種原因所致的斷肢再植十分常見，這就涉及到缺血再灌注的問題。盡可能縮短缺血時間是減少缺血再灌注損傷的根本。在缺血時間一定的條件下，如何減輕骨骼肌缺血再灌注損傷，關(guān)系到提高斷肢再植成活率及減輕患肢功能障礙的問題。至今已提出了眾多減輕缺血再灌注損傷的措施［1～4］，但并沒有形成一個理想的方案。有學(xué)者在心肌的缺血再灌注模型研究中發(fā)現(xiàn)，多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-fibose polymerase，PARP）在此過程中起重要作用，而應(yīng)用PARP的特異性抑制劑3-氨基苯甲酰胺（3-aminobenzamide，3AB），能減小心肌梗死面積，對心肌的缺血再灌注損傷有保護(hù)作用［5～7］。3AB對骨骼肌的缺血再灌注損傷是否有保護(hù)作用，尚未有報道。

1 材料與方法

1.1 實驗分組及模型制備

健康成年SD大鼠54只，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供，體質(zhì)量250～300 g。隨機(jī)分為缺血再灌注組、3AB組、空白對照組，每組根據(jù)再灌注時間6 h、24 h和48 h，分為3個小組，共9組，每組6只大鼠。

10%水合氯醛（3 mL/100 g體質(zhì)量）腹腔注射麻醉成功后，仰臥位固定四肢，消毒，分離暴露右下肢股動靜脈，用無創(chuàng)血管夾夾閉股動靜脈，造成大鼠右下肢缺血模型。肢體缺血4 h后，缺血再灌注組直接恢復(fù)血流再灌注；3AB組在徹底恢復(fù)血流灌注前15 min腹腔注射3AB（20 mg/kg）?？瞻讓φ战M只手術(shù)，不經(jīng)過缺血再灌注過程。各組在再灌注6 h、24 h、48 h結(jié)束時抽取心臟血液，取右下肢腓腸肌，隨后處死大鼠。

1.2 血漿乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、肌酸磷酸激酶（creatine phosphokinase，CPK）活性測定

自心臟采集的血液在室溫靜置10 min后，3 000 r/min離心10 min，收集上清液，用全自動生化儀（Roche Modular P800）測定血漿LDH、CPK活性。

1.3 患肢腓腸肌電鏡、組織學(xué)、免疫組化檢測

將右下肢腓腸肌分成4段：一段用于檢測肌肉內(nèi)丙二醛（malondiadehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；一段用于電鏡分析骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的變化；一段用于HE染色組織學(xué)檢查和免疫組化檢測，免疫組化用SP法，在自動免疫組化染色機(jī)中進(jìn)行，所用抗體有Porimin、Caspase-3，購自BioGenex公司；一段直接稱取濕重，然后將組織置于60℃恒溫箱中烤24 h至恒重，即為干重，計算出濕重與干重的比值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血漿LDH及CPK活性

血漿CPK和LDH活性變化可作為骨骼肌細(xì)胞損傷的指征。缺血再灌注組與3AB組的血漿LDH、CPK活性變化相似，同空白對照組相比，再灌注6 h時活性均顯著升高，此后回落至正常水平，見表1。

表1 3AB對骨骼肌缺血再灌注損傷的影響Tab.1 Effects of 3AB on skeletal ischemia reperfusion injury

2.2 骨骼肌濕重與干重的比值

骨骼肌濕重與干重的比值反映了肌肉組織的水腫程度，此比值越高說明肌肉水腫程度越重。同缺血再灌注組相比，再灌注48 h時，3AB組患肢腓腸肌濕重與干重的比值明顯降低；再灌注6 h和24 h時，兩者無明顯差異。2組同空白對照組相比，再灌注24 h和48 h時，患肢腓腸肌濕重與干重的比值均明顯升高，見表1。

2.3 組織MDA含量和SOD活性

MDA含量的高低反映了機(jī)體內(nèi)氧自由基的水平，SOD活力的高低反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。同缺血再灌注組相比，3AB組在再灌注6 h、24 h和48 h時SOD活性均明顯升高，其中48 h時顯著升高，而MDA含量在再灌注24 h時已顯著下降。同空白對照組相比，缺血再灌注組在再灌注6 h、24 h和48 h時患肢SOD活性均顯著降低，MDA含量均顯著增高；而3AB組只在再灌注6 h、24 h時MDA含量顯著升高，SOD活性無顯著降低，見表1。

2.4 組織學(xué)變化

空白對照組腓腸肌細(xì)胞形態(tài)正常，無炎細(xì)胞浸潤（圖1A）。再灌注6 h時，缺血再灌注組及3AB組改變基本相同，患肢腓腸肌大部分區(qū)域肌細(xì)胞形態(tài)正常，只局灶區(qū)域部分細(xì)胞內(nèi)可見空泡、裂隙，無或僅少量中性粒細(xì)胞浸潤。再灌注24 h時，缺血再灌注組的組織學(xué)改變顯著，大片區(qū)域出現(xiàn)細(xì)胞變性、溶解，明顯的中性粒細(xì)胞浸潤；再灌注48 h時，病變肌纖維與周圍相對正常肌纖維對比更加顯著，細(xì)胞核密度增加，同樣有明顯的中性粒細(xì)胞浸潤（圖1B）。3AB組再灌注24和48 h時變化類似缺血再灌注組，但病變范圍明顯局限，病變程度較輕，浸潤的中性粒細(xì)胞較少（圖1C）。

圖1 再灌注48 h時3組患肢腓腸肌組織學(xué)改變HE×200Fig.1 Gastrocnemius muscle histological changes of the 3 groups at 48 h after reperfusion HE×200

2.5 Porimin和Caspase-3的免疫組化

Porimin和Caspase-3的陽性著色均位于胞質(zhì)，呈棕黃色。空白對照組陰性。缺血再灌注組及3AB組，再灌注6 h時，二者均陰性。再灌注24和48 h時，可見陽性染色，陽性著色范圍與組織學(xué)形態(tài)改變范圍一致，陽性染色細(xì)胞形態(tài)上可見空泡、裂隙、溶解改變（圖2）。經(jīng)過比對，Porimin和Caspase-3的陽性部位重疊。

圖2 再灌注48 h時3組患肢腓腸肌Caspase?3的免疫組化×200Fig.2 Immunohistological changes of Caspase?3 in the 3 groups at 48 h after reperfusion×200

2.6 超微結(jié)構(gòu)變化

正常肌纖維排列整齊，肌纖維間見清楚的線粒體。損傷較輕者，肌纖維胞質(zhì)內(nèi)見較多的空泡，肌纖維間線粒體嵴減少、外膜模糊。損傷較重者，肌纖維部分溶解、線粒體外膜模糊，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張，肌細(xì)胞核膜腫脹，核內(nèi)異染色質(zhì)邊集、凝聚明顯。

3 討論

PARP是一類存在于多數(shù)真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，通過它的DNA修復(fù)功能，在維持基因組的穩(wěn)定和細(xì)胞的死亡過程中都發(fā)揮著重要作用。組織缺血再灌注損傷誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)會導(dǎo)致大量DNA損傷，從而誘發(fā)PARP過度激活，PARP過度激活可以介導(dǎo)一系列反應(yīng)，消耗大量的能量物質(zhì)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和三磷酸腺苷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，PARP在細(xì)胞死亡的分子機(jī)制鏈條中處于下游位置，是各種損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡的最終共同路徑［5～7］。在肝臟、大腦、心肌的缺血再灌注模型研究中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用PARP的抑制劑3AB能減輕器官的缺血再灌注損傷［5～7］。

我們的研究顯示在缺血4 h后，3AB組與缺血再灌注組都存在不同程度的缺血再灌注損傷，但兩者損傷程度不同。再灌注6 h時，3AB組與缺血再灌注組相比，僅SOD活性升高，其余改變近似，表明2組在再灌注早期（6 h）組織損傷的程度相似，但3AB組清除氧自由基的能力高于缺血再灌注組。再灌注24 h時，3AB組在MDA含量下降、SOD活性升高方面較缺血再灌注組有顯著差異。3AB組的組織學(xué)改變范圍及Porimin和Caspase-3免疫組化陽性范圍均較缺血再灌注組明顯局限。此時，3AB組表現(xiàn)出較明顯的保護(hù)作用。再灌注48 h時，相比缺血再灌注組，3AB組除延續(xù)再灌注24 h的各項差異外，患肢腓腸肌的濕重與干重的比值明顯下降。表明3AB組繼續(xù)表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用。

我們的研究結(jié)果顯示，在再灌注開始時應(yīng)用3AB對于缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用，主要體現(xiàn)在再灌注稍后期（再灌注24 h、48 h）階段，可作為骨骼肌缺血再灌注損傷的防治措施之一。缺血再灌注損傷最終對機(jī)體的影響取決于損傷肢體的恢復(fù)程度，因此3AB對骨骼肌缺血再灌注損傷的最終防護(hù)作用還需要長期隨訪研究。

除此以外，我們還觀察到骨骼肌缺血再灌注損傷中，凋亡和脹亡的并存現(xiàn)象。以前認(rèn)為細(xì)胞的死亡有兩種主要形式：壞死和凋亡，他們是截然不同的過程和生物現(xiàn)象。隨著對細(xì)胞死亡的研究，現(xiàn)在認(rèn)為細(xì)胞的死亡過程包括凋亡、脹亡、自噬性細(xì)胞死亡等模式，而壞死代表了細(xì)胞死亡的最后結(jié)局，而且凋亡和脹亡有不同的但重疊的調(diào)節(jié)路徑［8，9］。在本研究的骨骼肌缺血再灌注模型中，可見脹亡的形態(tài)改變：細(xì)胞腫脹，內(nèi)可見空泡、裂隙，甚至細(xì)胞溶解的改變，電鏡下可見線粒體外膜模糊、破損，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張，肌細(xì)胞核形不規(guī)則，核膜腫脹。還可見凋亡的形態(tài)改變：核密度增加，內(nèi)異染色質(zhì)邊集、凝聚。除形態(tài)改變外，在介導(dǎo)細(xì)胞脹亡中起重要作用的膜特異性受體Porimin，在凋亡中發(fā)揮核心作用但在脹亡細(xì)胞中陰性表達(dá)的Caspase-3，二者免疫組化的陽性表達(dá)也支持缺血再灌注損傷中存在凋亡和脹亡現(xiàn)象。而且Porimin和Caspase-3的陽性表達(dá)部位是一致的，可以推測骨骼肌缺血再灌注過程中凋亡和脹亡是并存的。

3AB組同缺血再灌注組相比，組織學(xué)改變范圍、Porimin和Caspase-3的陽性范圍明顯局限，病變程度輕，表明3AB組的細(xì)胞凋亡和脹亡數(shù)量較缺血再灌注組減少?？梢酝茰y3AB組在缺血再灌注損傷的后期恢復(fù)中，細(xì)胞死亡的數(shù)量較缺血再灌注減少，損傷肢體的功能恢復(fù)較好，這亦需要對3AB在骨骼肌缺血再灌注損傷中的防護(hù)作用進(jìn)行長期隨訪研究。

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（編輯 陳姜）

3-aminobenzamide Attenuates Ischemia Reperfusion Injury ofSkeletalMuscle

TIAN Bao-ling1，LIQi2，JILian1，LIUXiao-mei1，YANGXiang-hong1
（1.Department of Pathology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Hand Surgery，Affiliated Central Hospital of Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110024，China）

ObjectiveTo investigate the protection effect of 3-aminobenzamide（3AB），and the existence of apoptosis and oncosis in ischemia reperfusion injury of skeletal muscle.MethodsTotally 54 adult SD rats were randomly divided into control groups，ischemia reperfusion groups，and 3AB groups，which underwent 4 h of ischemia and different phases of reperfusion.The lactic dehydrogenase（LDH），creatine phosphokinase（CPK），superoxide dismutase（SOD）activity，malondiadehyde（MDA）content were determined.The changes of histology，immunohistology，and ultramicrostructure were observed.ResultsCompared with ischemia reperfusion groups，3AB groups showed obvious differences in MDA content，SOD activity，wet-to-dry weight ratio，histological and immunohistological changes.Conclusion3-aminobenzamide has protected effects on ischemia reperfusion ofskeletalmuscle.Apoptosisand oncosis coexistduring the ischemia reperfusion injury.

ischemia reperfusion injury；3-aminobenzamide；skeletal muscle

R364.1

A

0258-4646（2014）10-0906-04

遼寧省教育廳高?？蒲杏媱潱↙2010574）

田保玲（1973-），女，講師，博士. E-mail：tianbaoling7@163.com

2014-07-21

網(wǎng)絡(luò)出版時間：