HBV母嬰垂直傳播相關影響因素研究

牛兆儀 王芳 靳晴 顧玨 余霞 初正敏 李碧霞 李麗榮

昆明市延安醫院婦產科，云南昆明 650051

HBV母嬰垂直傳播相關影響因素研究

牛兆儀 王芳 靳晴 顧玨 余霞 初正敏 李碧霞 李麗榮

昆明市延安醫院婦產科，云南昆明 650051

目的 探討妊娠合并HBV感染的孕婦母嬰垂直傳播的相關影響因素。方法 收集100例乙肝病毒攜帶孕婦及其100例新生兒作為研究對象，采用雙抗體夾心時間分辨免疫熒光法（IFMA法）檢測孕婦HBsAg和HBeAg，實時熒光定量PCR法檢測HBV DNA載量，并用流式細胞儀檢測新生兒臍血中NK細胞CD69和IFN-γ，并對以上指標的相關性進行統計分析。結果母血中HBsAg單陽性與HBsAg/HBeAg雙陽性組間母嬰垂直傳播比率差異有統計學意義（P＜0.001）；孕婦外周血HBV DNA載量越高母嬰垂直傳播幾率越高。妊娠合并乙型肝炎患者中HBV母嬰垂直傳播組、未發生HBV母嬰垂直傳播患者與正常對照組三組間臍血中 T淋巴細胞中活化標志物CD69表達的細胞百分比分別為：（9.58±1.745）%、（15.6±2.117）%和（5.66±3.724）%，差異有統計學意義（P＜0.001）。HBV母嬰垂直傳播與IFN-γ無明顯相關性（P＞0.05）。 結論 母血HBeAg陽性與否、HBV DNA病毒載量高低直接決定著母嬰HBV垂直傳遞的風險，同時T淋巴細胞中活化標志物CD69表達水平與母嬰HBV垂直傳播相關，該研究的結果為臨床研究HBV母嬰傳播的機理及其預防措施，減少HBV攜帶者，提高新生兒出生質量有重要意義。

HBV感染；母嬰垂直傳播；影響因素

我國是乙型肝炎的高發區，母嬰傳播是乙型肝炎病毒（HBV）傳播的一條重要途徑，亞洲HBV感染者中有30%～50%是通過母嬰傳播形成的，我國每年約26萬新生兒通過母嬰傳播途徑感染HBV[1]，阻止母嬰傳播是控制乙肝流行的主要環節。大量的研究發現NK細胞在HBV感染早期的病毒清除和慢性HBV感染患者肝臟病變過程中都起到了十分重要的作用，但關于NK細胞在HBV母嬰傳播中的作用并不清楚，因此，該研究檢測妊娠合并HBV感染的孕婦及其新生兒的外周血的HBsAg、HBeAg以及HBV DNA載量，并檢測臍血中NK細胞表面IFN-γ和CD69的表達水平，以探討NK細胞在HBV在母嬰傳播中的作用。報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

根據2005年中華醫學會肝病學分會修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準，選擇2009年1月—2013年12月在云南省昆明市延安醫院婦產科分娩的無癥狀乙肝病毒攜帶孕婦共計100例（母血中HBsAg單陽性、HBsAg/HBeAg雙陽性）及其新生兒100例作為研究對象。所選病例孕期均無先兆流產或先兆早產及妊娠期高血壓病史以及無其他原發性疾病，肝功能正常，孕期未使用其他研究藥物或全身抗病毒、細胞毒性、類固醇激素或免疫調節劑等藥物。另外，收集同期就診的乙型肝炎病毒攜帶隱性的健康孕婦分娩的新生兒臍血40例作為正常對照，其中病例組與正常對照組間分娩時胎齡均在36～41周之間，分娩方式均按正常待產擬定治療方案，兩組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 孕婦分娩前采集靜脈血3 mL，分兩份分離血清，分別進行HBV DNA檢測和乙型肝炎5項檢測。新生兒于分娩時在碘伏消毒過的臍帶處采集臍血5 mL，分離血清做HBV DNA檢測，分娩12 h內采集橈動脈血，分離血清儲存于-20℃中保存待測。

1.2.2 檢測方法 ①乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）采用雙抗體夾心時間分辨免疫熒光法（IFMA法）：采用WALLAC公司1235全自動時間分辨熒光測定儀對妊娠合并乙型肝炎患者、新生兒、新生兒臍帶血進行乙肝兩對半定量檢測。②HBV DNA定量檢測采用熒光定量PCR法（美國Bio-Rad公司的DA7600型核酸擴增實時熒光檢測系統及上海夏華生物醫學工程有限公司實時熒光定量PCR試劑盒），分別設計一堆乙型肝炎病毒特異性引物和一條乙型肝炎病毒特異性熒光探針，用PCR體外擴增發定量檢測乙型肝炎病毒DNA，標本的HBV DNA含量以copies/ml表示。③新生兒臍血中NK細胞CD69和IFN-γ采用流式細胞儀（美國BD公司的FACS-Calibur流式細胞儀）檢測，取 CD3、CD56和CD69抗體（Biolegend公司提供）各5 μL和100 μL血樣混勻避光孵育20 min，然后加入1 mL溶血素混勻作用5 min，離心棄上清后加入1M1×LPBS，再離心并棄上清，加入200 μL 1×LPBS上機檢測。

1.3 新生兒HBV感染的判定標準

HBV感染判定標準新生兒外周血HBsAg陽性和/或HBV DNA陽性判定為HBV感染存在。

1.4 統計方法

采用SPSS17.0統計軟件包進行統計學分析。運用四格表確切概率法及χ2檢驗比較組間差異。計量資料均以均數±標準差表示,兩組樣本組間比較采用t檢驗，兩組以上均數比較采用方差分析。

2 結果

2.1 母血中HBsAg、HBeAg與HBV母嬰垂直傳播的關系

ELISA法檢測100例妊娠合并乙型肝炎病毒感染的孕婦，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）單陽性發生母嬰垂直傳播率為1.75%；乙肝表面抗原及e抗原（HBsAg/HBeAg）雙陽性患者發生母嬰垂直傳播率為46.51%，患兒橈動脈血乙肝兩對半檢測為HBsAg或HBeAg陽性，采用χ2檢驗對結果進行分析，見表1。（HBsAg正常值0～0.2 ng/mL、HBeAg正常值0～0.5 PEIU/mL）。母血中HBsAg單陽性與HBsAg/HBeAg雙陽性其發生HBV母嬰垂直傳播率差異有統計學意義（P＜0.001），可認為母血中HBsAg單陽性與HB-sAg/HBeAg雙陽性與發生HBV母嬰垂直傳播有相關性。

表1 母血中HBsAg、HBeAg與HBV母嬰垂直傳播的關系

2.2 母血外周血HBV DNA病毒載量與HBV母嬰垂直傳播的關系

產婦外周血HBV DNA按病毒載量由低到高分為3組：HBV DNA≤105 copies/mL、105 copies/mL＜HBV DNA＜106 copies/mL、HBV DNA≥106 copies/mL，這3組產婦分娩的新生兒分別有56例、4例和40例，相應的新生兒橈動脈血HBV DNA陽性率分別為0%（0/56）、25%（1/4）、50%（25/50）。孕婦外周血HBV DNA載量越高，其新生兒HBV DNA陽性率越高，且組間差異有統計學意義（P＜0.001）。見表2。

表2 不同母血外周血HBV DNA載量所生嬰兒感染率的比較

2.3 新生兒臍血NK細胞表面IFN-γ和CD69表達水平與HBV母嬰垂直傳播的關系

妊娠合并乙型肝炎患者中HBV母嬰垂直傳播組臍血中T淋巴細胞中活化標志物 CD69表達的細胞百分比為（9.58± 1.745）%，未發生HBV母嬰垂直傳播患者臍血中T淋巴細胞中活化標志物CD69表達的細胞百分比為（15.6±2.117）%；正常對照組為（5.66±3.724）%，3組間T淋巴細胞中活化標志物CD69表達的細胞百分比差異有統計學意義（P＜0.001）。見圖1。可認為HBV母嬰垂直傳播與CD69表達具有相關性。而IFN-γ的表達在3組間差異無統計學意義。

圖1 T淋巴細胞中活化標志物CD69表達的比較

3 討論

發生HBV母嬰垂直傳播有3種可能的途徑：產前傳播、產時傳播和產后感染，目前普遍認為分娩過程中的HBV感染是圍產期感染的主要途徑。HBV宮內感染難以阻斷，并且是新生兒HBV感染的主要途徑。

該研究結果顯示，HBV母嬰垂直傳播與母血中HBsAg單陽性與HBsAg/HBeAg雙陽性，母嬰垂直傳播比率差異有統計學意義（P＜0.001），許多研究也得到與該研究相同的結論，新生兒HBV感染和母親血清中e抗原陽性明顯相關[2]。乙型肝炎e抗原是存在于病毒顆粒之外的一種可溶性蛋白，有研究發現，HBeAg能夠通過胎盤，引起胎兒對HBeAg的T細胞耐受，從而導致免疫功能低下，在這種情況下，暴露于高濃度母血HBV的胎兒就更容易被感染。因此，HBeAg不僅僅是高傳染性的標志，其本身也可能通過影響胎兒免疫系統，從而增加感染的風險[3-5]。研究發現HBV宮內感染主要在孕晚期經胎盤感染胎兒，隨著孕婦血清HBV DNA水平增高，胎兒發生宮內感染的危險性呈增高趨勢[6]。當孕婦血清中HBV DNA水平＞108拷貝/mL時，即使采用產后雙重免疫宮內感染仍可達43%左右[6]，而母血中HBV DNA水平在106拷貝/mL以下時，將減少30%的HBV宮內感染母嬰垂直傳播危險[7]。該研究結果顯示，隨孕婦外周血HBV DNA病毒載量水平增高，胎兒發生HBV母嬰傳播風險呈增高趨勢：妊娠合并乙型肝炎患者外周血HBV DNA病毒載量＜105 copies/mL的患者未發現母嬰垂直傳播；母血HBV DNA病毒載量大于105 copies/mL的產婦可能母嬰傳播，尤其是母血HBV DNA病毒載量＞106 copies/ mL的產婦，50%發生母嬰HBV傳播。因此，HBV DNA是反映HBV攜帶者傳染性的直接指標，孕婦血清HBV DNA水平確實與母嬰HBV傳播有關，且母血HBV DNA高載量（≥106 copies/ mL）可能是HBV母嬰傳播的高危因素。

CD69被稱為早期激活抗原或活化誘導分子，是表達經抗原刺激后各種激活T細胞、NK細胞、B細胞、單核巨噬細胞、中性和嗜酸粒細胞、胸腺細胞表面，當其表達后，可作為共刺激信號促進T淋巴細胞進一步活化和增殖。Goncalves等[8]通過對HBV疫苗的研究發現T細胞CD69表達與HBV感染關系密切，認為T細胞CD69表達的降低是機體對HBV無反應的結果。該研究發現，健康產婦組的臍血T淋巴細胞中活化標志物CD69表達的細胞百分比處于低水平（5.66%），而妊娠合并乙型肝炎患者發生母嬰HBV垂直傳播組和未發生HBV母嬰垂直傳播組臍血中T淋巴細胞中活化標志物CD69表達的細胞百分比高于正常對照組，特別是妊娠合并乙型肝炎患者未發生HBV母嬰垂直傳播組臍血中T淋巴細胞中活化標志物CD69表達的細胞百分比（15.6%）顯著高于垂直傳播組（9.58%）。可見，CD69的表達與HBV母嬰垂直傳播有相關性。T淋巴細胞中活化標志物CD69表達的細胞百分比的升高有利于機體免疫系統對HBV的清除，從而降低HBV母嬰垂直傳播的風險。

IFN-γ主要由活化的NK細胞和Th細胞產生，其生物學功能主要是免疫調節，誘導多種抗原提呈細胞表達MHCⅠ/Ⅱ分子，活化單核、巨噬細胞并增強其溶菌活性及分泌IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等,也是促進T細胞分化和CD8+CTLs成熟的重要因子[9]。研究發現，Th1細胞分泌的IFN-γ能在轉錄后水平抑制肝炎病毒，同時IFN-γ誘導及活化NK細胞，又能通過免疫調節增強機體的防御能力。NK細胞IFN-γ表達量的增加可能在HBV清除中起到十分重要的作用[10]。該研究結果顯示，妊娠合并乙肝病毒感染的孕婦發生HBV垂直傳播組、非垂直傳播組和正常對照組NK細胞表面IFN-γ表達的差異無統計學意義。因此IFN-γ表達與HBV母嬰垂直傳播的相關性有待進一步的研究。

綜上，該研究發現母血HBeAg陽性與否、HBV DNA病毒載量高低直接決定著母嬰HBV垂直傳遞的風險，同時T淋巴細胞中活化標志物CD69表達水平與母嬰HBV垂直傳播相關，該研究的結果為臨床研究HBV母嬰傳播的機理及其預防措施，減少HBV攜帶者，提高新生兒出生質量有重要意義。

[1]齊秀花,王明園,姜建慧.預防乙型肝炎病毒母嬰傳播的臨床研究.中國醫療前沿[J],2009,4(18):20.

[2]Trehanpati N,Hissar S,Shrivastav S,et al.,Immunological mechanisms of hepatitis B virus persistence in newborns[J].The Indian journal of medical research,2013，138(5):700.

[3]Wang Z,J,Zhang H,Yang,et al.Quantitative analysis of HBV DNA level and HBeAg titer in hepatitis B surface antigen positive mothers and their babies:HBeAg passage through the placenta and the rate of decay in babies[J].Journal of medical virology,2003,71(3):360-366.

[4]Milich D,Liang TJ.Exploring the biological basis of hepatitis B e antigen in hepatitis B virus infection[J].Hepatology,2003，38(5):1075-1086.

[5]Shiraki K.Perinatal transmission of hepatitis B virus and its prevention[J]. Journal of gastroenterology and hepatology,2000,15(s2):E11-E15.

[6]Han GR,Cao MK,Zhao W,et al.A prospective and open-label study for the efficacy and safety of telbivudine in pregnancy for the prevention of perinatal transmission of hepatitis B virus infection[J].Journal of hepatology,2011,55(6):1215-1221.

[7]Choe BH,Lee JH,Jang YC,et al.Long-term therapeutic efficacy of lamivudine compared with interferon-α in children with chronic hepatitis B:The younger the better[J]Journal of pediatric gastroenterology and nutrition,2007,44(1):92-98.

[8]Akbar S,Inaba K,Onji M.Upregulation of MHC class II antigen on dendritic cells from hepatitis B virus transgenic mice by interferongamma:abrogation of immune response defect to a T-cell-dependent antigen[J].Immunology,1996,87(4):519.

[9]舒凱,黃秋香,張現臣.乙肝疫苗新型佐劑 CpG-BW006對小鼠脾NK細胞表面分子CD69的表達及y干擾素分泌的影響[J].生物技術通訊,2013(2):219-221.

[10]Zhao J,Li Y,Jin L,et al.Natural Killer Cells Are Characterized by the Concomitantly Increased Interferon-γ and Cytotoxicity in Acute Resolved Hepatitis B Patients[J].PloS one,2012,7(11):e49135.

·編讀往來·

論文寫作技巧——題名

1.題名應以準確、簡明的詞語反映文章中最重要的特定內容。一般使用能充分反映論文主題內容的短語，不使用具有主、謂、賓結構的完整語句。一般不設副題名。一般不超過20字。

2.題名應盡量避免使用非公知公認的縮略語、字符、代號等，也不應將原形詞和縮略語同時列出。

3.英文題名應與中文題名含義一致。

4.題名轉行應保持詞語的完整。完整的詞拆開轉行，虛詞（例如"的"字）應盡可能留在行末，而連接詞（例如“和”、“與”、“及其”等）不宜留在行末。

Study on the Influencing Factors Related to Mother-to-child Vertical Transmission of HBV

NIU Zhaoyi WANG Fang JIN Qing GU Jue YU Xia CHU Zhengmin LI Bixia LI Lirong
Obstetrics and Gynecology Department,Yan'an Hospital of Kunming City,Kunming,Yunnan Province,650051,China

Objective To investigate the influencing factors related to mother-to-child vertical transmission of hepatitis B virus infection.Methods 100 cases of hepatitis B virus carrying pregnant women and their 100 newborns were selected as the research object.HBsAg and HBeAg of the pregnant women were detected by IFMA method,and HBV DNA load of them was detected by real-time PCR.NK cells CD69 and IFN-γ in the umbilical cord blood of the newborns were detected by flow cytometry.And the relativity between the above indexes was analyzed statistically.Results The difference in the ratio of mother-to-child vertical transmission of HBV between the pregnant women with positive HBsAg and those with double positive HBsAg/HBeAg was statistically significant(P＜0.001).The higher HBV DNA load in the maternal blood,the higher HBV mother-to-child vertical transmission ratio would be.T lymphocyte activation marker CD69 expression levels in the hepatitis group with mother-to-child vertical transmission of HBV,hepatitis group without mother-to-child vertical transmission of HBV,and the normal control group was(9.58± 1.745)%,(15.6±2.117)%,(5.66±3.724)%,respectively,the difference was statistically significant(P＜0.001).And mother-to-child vertical transmission of HBV had no significant relativity with IFN-γ(P＞0.05).Conclusion Positive HBeAg and HBV DNA load in the maternal blood are associated with the risk of mother-to-child vertical transmission of HBV.And T lymphocyte activation marker CD69 expression levels are related to mother-to-child vertical transmission of HBV.The results of this study are about the mechanism and preventive measures of mother-to-child vertical transmission of HBV clinically,which are of great significance in reducing the HBV carriers and improving the quality of neonates.

Hepatitis B virus infection;Mother-to-child vertical transmission;Influencing factor

R4

A

1674-0742（2014）10（a）－0044-03

2014-06-24）

云南省科技廳科研基金（2009CD128）。

牛兆儀(1961,7-),女,云南昆明人,本科,主任醫師,研究方向:產科疑難病診療。

王芳(1972,4-),女,云南昆明人,本科,副主任醫師,研究方向:婦產科。