基于分子對接方法的肺癌分子靶標耐藥機制研究

龔雨晨 高軍暉

1.無錫大橋中學，江蘇無錫 214135；2.上海生物信息技術研究中心，上海 200235

基于分子對接方法的肺癌分子靶標耐藥機制研究

龔雨晨1高軍暉2

1.無錫大橋中學，江蘇無錫 214135；2.上海生物信息技術研究中心，上海 200235

目的 探討吉非替尼為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑 （epidermal growth factor receptor tyrosine kinases inhibitor，EGFR-TKI）在治療非小細胞肺癌中起到的作用。方法雖然部分患者治療后產生獲得性耐藥，其耐藥機制尚未完全闡明。但本文將研究第790位密碼子突變導致吉非替尼耐藥的原理。利用Arguslab軟件，模擬并分析吉非替尼與EGFR野生型和變異型蛋白的結合情況，試圖對EGFR-TKI的耐藥機制作出解釋。結果 野生基因2GS6與吉非替尼結合所需能量為-8.07 kcal/mol，低于2GS6與ATP結合所需能量-7.78 kcal/mol，2GS6基因突變為3IKA后，受體蛋白與吉非替尼的結合能力降低至-6.96 kcal/mol，與ATP的結合能力提升至-8.41 kcal/mol。結論2GS6更易與吉非替尼結合，患者對吉非替尼藥物敏感，具有臨床意義。

非小細胞肺癌；表皮生長因子受體；酪氨酸激酶抑制劑；耐藥性；分子對接

肺癌是最常見惡性腫瘤之一，其中約80%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[1]。手術切除輔以化療是對其治療的主要手段。然而，多數患者確診時已為晚期，失去了手術機會，只有約30%的NSCLC患者可以采用手術切除。而放、化療治療NSCLC的疾病緩解率非常之低，分別只有25%～35%和15%～20%[2-4]，因此。但該文將研究第790位密碼子突變導致吉非替尼耐藥的原理。利用Arguslab軟件，模擬并分析吉非替尼與EGFR野生型和變異型蛋白的結合情況對EGFR-TKI的耐藥機制作出解釋，下面將研究結果總結報道如下。

1 樣本資料

1.1 蛋白結構

從PDB網站下載受體材料2GS6.pdb（野生型受體蛋白）和3IKA.pdb（突變受體蛋白）。

1.2 藥物分子及ATP分子

從pubchem網站下載配體材料CID_5957.sdf（吉非替尼）和CID_123631.sdf（ATP)。

1.3 方法

1.3.1 對接前準備

1.3.1.1 格式轉換 用Openbabel軟件將CID_5957.sdf和CID_123631. sdf轉換成mol格式。

1.3.1.2 定義活性位點 目前文獻報道的EGFR基因突變大多數位于第 719,746～752,761,770～776,790,851,854,858位密碼子[8-10]，該文將定義這些密碼子為對接活性位點。

1.3.1.3 去除水和雜質 用Arguslab軟件選中水分子和雜質并刪除。

1.3.2 分子對接 該文研究790位密碼子變異導致的吉非替尼耐藥現象。用Arguslab軟件對2GS6、3IKA和吉非替尼、ATP進行兩兩組合，計算各自的最佳結合位點。

1.3 統計方法

使用Arguslab軟件對2GS6、3IKA和吉非替尼、ATP結合情況進行分析。

2 結果

表1是兩類組合的對接結果，表內數據代表受體與配體結合所需能量。結合所需能量越低，結合越容易。

表1 Arguslab軟件計算結果

EGFR蛋白可與ATP結合，激活細胞的分裂、增殖等生理功能。也可與吉非替尼等小分子藥物結合，藥物占據了受體上的位置，ATP就不能再接近受體，因而起了一種阻滯的效果[11]。比較表中數據可以發現，野生基因2GS6與吉非替尼結合所需能量為-8.07 kcal/mol，低于2GS6與ATP結合所需能量。證明了2GS6更易與吉非替尼結合，患者對吉非替尼藥物敏感。

2GS6基因突變為3IKA后，受體蛋白與吉非替尼的結合能力降低至-6.96 kcal/mol，與ATP的結合能力提升至-8.41 kcal/mol。突變后的3IKA受體蛋白與ATP的結合能力遠大于與吉非替尼的結合能力，因而更易與ATP結合，臨床表現為患者對吉非替尼產生耐藥。研究認為，關鍵基因突變導致受體蛋白結構發生變化，藥物靶位也隨之改變。蛋白與藥物的結合能力下降，與ATP的結合能力增加，影響吉非替尼與其靶部位的結合，引起EGFR-TKI耐藥。

3 討論

近10年來，腫瘤分子靶向藥物治療因特異性好，不良反應小，正逐漸成為臨床腫瘤化療的主流。目前，臨床治療NSCLC應用最廣的分子靶向藥是以吉非替尼(gefitinib)為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑 (epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibiter，EGFR-TKI)。EGFR是受體酪氨酸激酶（tyrosine kinase,TK）erbB／HER家族成員之一，由細胞外的配體結合區、胞內的蛋白酪氨酸激酶區，和二者之間的疏水跨膜結構域構成。當EGFR與配體結合后，進行同源或異源二聚化，引起胞內酪氨酸殘基自身磷酸化，而后激活下游的轉導通路，參與控制細胞分裂和增殖等生理功能。轉導通路中任何蛋白異常表達，都會將增殖信號錯誤地傳至細胞核，促使細胞異常增生[5]。EGFR在許多惡性腫瘤中存在過高表達，因此成為了肺癌分子靶向藥物治療的熱點，由以上結果可知，該研究使用的Arguslab軟件，計算出EGFR第790位密碼子突變的情況下，吉非替尼、ATP分別與野生型蛋白2GS6，突變蛋白3IKA結合所需要的能量，其中，野生基因2GS6與吉非替尼結合所需能量為-8.07kcal/mol，低于2GS6與ATP結合所需能量-7.78 kcal/mol，2GS6基因突變為3IKA后，受體蛋白與吉非替尼的結合能力降低至-6.96kcal/mol，與ATP的結合能力提升至-8.41 kcal/mol，突變后的3IKA受體蛋白與ATP的結合能力遠大于與吉非替尼的結合能力，因而更易與ATP結合，臨床表現為患者對吉非替尼產生耐藥，以上結果與張浩等[10]在關于基于分子對接方法的中藥抗炎機制研究中所研究的數據相一致，具有臨床意義，臨床也證明2GS6更易與吉非替尼結合，患者對吉非替尼藥物敏感。

且經研究發現亞裔、女性、非吸煙、腺癌的NSCLC患者常對EGFR-TKI類藥物敏感[6]。進一步的研究證實對EGFR-TKI敏感的NSCLC患者常攜帶EGFR基因突變，最常見的是19外顯子的缺失突變(delE746．A750)和21外顯子的錯義突變(L858R)[7]。然而，隨著治療時間的增長，臨床中有些患者對EGFR-TKI的治療藥物最終產生獲得性耐藥。導致獲得性耐藥的原因主要有EGFR的二次突變，腫瘤誘導的非依賴于EGFR的血管生成，胞內EGFR下游信號蛋白非依賴性或組成性活化。其中，EGFR第790位密碼子的二次突變是獲得性耐藥發生的重要原因。然而目前基因突變對EGFR-TKI的耐藥機制尚未完全闡明，還需臨床廣泛探討與研究。

[1]Chen Z,Cheng K,Walton Z,et al.A murine lung cancer co-clinical trial identifies genetic modifiers of therapeutic response[J].Nature,2012, 483(7391):613-617.

[2]Ahn MJ,Park SY,Kim WK,et al.A single nucleotide polymorphism in the phospholipase D1 gene is associated with risk of non-small cell lung cancer[J].Int J Biomed Sci,2012,8(2):121-128.

[3]Benaiges D,Zanui M,Chillaron JJ,et al.Two cases of pituitary metastases as initial presentation form of small cell lung cancer[J].Invest Clin,2012,53(4):402-407.

[4]Shrestha S,Joshi P.Gefitinib monotherapy in advanced non-small-cell lung cancer:A retrospective analysis[J].JNMA J Nepal Med Assoc,2012, 52(186):66-71.

[5]趙寶霞.EGFR突變型NSCLC的EGFR—TKI耐藥機制體外研究[D].大連：大連醫科大學,2013:15.

[6]Pao W,Miller V,Zakowski M.EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from"never smokers"and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib[外文期刊]2004.

[7]Takezawa K，Okamoto I，Tanizaki J，et al．Enhanced anticancer effect of the combination of BIBW2992 and thymidylate synthase-targeted agents in non·-small cell lung cancer with the T790M mutation of epidermal growth factor receptor[J]．Mol Cancer Ther，2010，9(6)：1647-1656．

[8]趙寶霞.EGFR突變型NSCLC的EGFR—TKI耐藥機制體外研究[D].大連：大連醫科大學,2013：15-16.

[9]王敬萍,鄭華,李寶蘭,等.EGFR基因突變與肺癌EGFR-TKI獲得性耐藥的研究進展[J]實用臨床醫藥雜志，2008,12（5）：12.

[10]張浩,昝金行,龍偉，等.基于分子對接方法的中藥抗炎機制研究[J].醫藥導報,2012(12)：1542-1546.

[11]李媛,宋麗華.非小細胞肺癌分子靶向治療中EGFR-TKI的耐藥機制研究進展[J].中國肺癌雜志,2012(2)：106-111.

R734.2

A

1674-0742（2014）10（a）－0090-02

2014-06-28）

龔雨晨（1997-），女，江蘇張家港人，中學生。

高軍暉（1968-），男，杭州人，本科，副研究員，主要從事生物信息、醫學信息工作。