氣體二氧化氯對小麥表面細菌殺滅效果研究及菌種鑒定

,, ,,

(中北大學化工與環境學院,山西太原 030051)

小麥在生產運輸貯藏過程中表面易染菌,染菌小麥不同程度地存在著質量和安全隱患[1]。為防止小麥在加工前表面染菌,增加其安全性,國內外以多菌靈[2]、紅外線[3-4]、紫外線、臭氧、福美雙和三唑酮等為主[5]對小麥的表面進行殺菌。這些方式都對小麥表面的微生物具有一定的殺滅作用,但是它們殺菌效率低、殺菌不徹底、殺菌劑有殘留,且存在不易實現大面積殺菌的缺點。作為目前國際上公認的新一代廣譜、高效、安全的綠色殺菌劑[6],二氧化氯幾乎對所有細菌、霉菌、真菌、病毒都有殺滅作用[7],且殺菌后無殘留,已經被應用于食品[8-9]和公共場所[10]等方面的殺菌消毒,但直接用于對小麥表面的殺菌報道較為少見。本文以氣體二氧化氯作為殺菌劑,研究了不同條件下其對小麥表面細菌的殺滅效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥 山西省糧油科學研究所提供;亞氯酸鈉 天津市光復精細化工研究所;氯化鈉 天津市申泰化學試劑有限公司;無水乙醇 天津市德恩化學試劑有限公司;氫氧化鈉 南京化學試劑有限公司;牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉 北京奧博星技術有限公司;濃鹽酸 太原化肥廠化學試劑廠。

ESJ200-4型電子分析天平 沈陽龍騰電子有限公司;BJ-2CD型凈化工作臺、YXQ-LS-18S1型自動手提式滅菌器、SPX-250B-Z型生化培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;JB-3型定時恒溫磁力攪拌器 上海雷滋新涇儀器有限公司;WDYV1-1000型微量移液器 上海求精生化試劑儀器有限公司;TYJ-2A型菌落計數器 上海華光儀器儀表有限公司;ZDHW型電熱套 北京中興偉業儀器有限公司;UV-9600紫外/可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司;BCD-202K利萊克斯家用電冰箱 伊萊克斯(中國)電器有限公司;自制滅菌柜 約334L。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 稱量:稱取牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g加入1000mL燒杯中;溶解:在該燒杯中加水至800mL左右,用玻璃棒攪拌均勻,電熱套加熱使其全部溶解;調節pH至7;定容:將調好pH的培養基加水定容至1000mL;分裝:將配制好的培養基分裝入三角燒瓶中;加凝固劑:稱取一定量(約培養基量的25%)的瓊脂粉加入分裝有培養基的三角瓶中;滅菌:包扎后,在121.3℃和高壓下將培養基滅菌20min;傾注平皿:將滅菌后的培養基在凝固之前倒入滅過菌的培養皿中,約15～20mL。

1.2.2 實驗用品滅菌 稱取4.25g NaCl配制500mL生理鹽水,之后將其分裝成每份225mL于三角瓶中,加塞包扎高壓蒸汽滅菌(0.075MPa,15min);涂布器、槍頭、500mL空三角瓶、培養皿,高壓蒸汽滅菌(0.1MPa,25min)。

1.2.3 小麥滅菌 將稱取好的小麥樣品平鋪在滅菌柜內,密封后,使二氧化氯氣體產生,氣體二氧化氯對小麥的殺菌濃度梯度分別為1、2、4、6、8、10mg/L,滅菌時間為3h,滅菌完成后打開滅菌柜取樣檢測樣品上剩余的細菌總量。

1.2.4 接種及菌落計數

1.2.4.1 接種及培養 稱取殺菌前后樣品,根據GB/T4789.2-2008食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定[11]的實驗步驟,采用10倍遞增稀釋法稀釋菌懸液,分別進行平板涂布,在37℃恒溫培養箱中培養48h。

1.2.4.2 菌落計數 用菌落計數器進行計數,殺菌前后微生物總量的測定方法相同,微生物總數測定采取標準平板菌落計數法[11],殺菌率按照如下公式進行計算。

式(1)

式中,N1表示殺菌前平均菌落數;N2表示殺菌后平均菌落數。

1.2.5 染色實驗 采用平板分離法[12]從染菌的小麥計數平板上長出的菌落中分別挑取培養基中菌落數最多(具有代表性)的2種微生物,標記為X1、X2,對這2種微生物分別進行革蘭氏染色實驗和芽孢染色實驗。

1.2.5.1 革蘭氏染色 制片:取活躍生長期菌種按常規方法涂片、干燥和固定。

染色:初染:滴加草酸結晶紫染液覆蓋涂菌部位,染色2min,水洗至流出水無色;媒染:用盧戈氏染液沖去殘留水跡,再用碘液覆蓋1min,傾去碘液,水洗至流出水無色。脫色:將玻片上的水用吸水紙吸取,用滴管滴加95%乙醇脫色(持續20s),稍后立即洗去乙醇。復染:將玻片上的水用吸水紙吸去,用番紅復染液染色2min,水洗,吸去殘水烤干。

鏡檢:分別用香柏油覆蓋涂菌部位,先用低倍鏡找到菌,換用100倍的物鏡觀察染色情況。觀察結束后,用二甲苯擦洗鏡頭。

1.2.5.2 芽孢染色 制片:按常規涂片、干燥、固定。

染色:加數滴5%孔雀綠染液于涂片上,用木夾夾住載玻片一端,在微火上加熱至染料冒蒸汽并開始計時。維持5min。加熱過程中及時補充染液，切勿讓涂片干涸。

水洗:待玻片冷卻后,用緩流自來水沖洗載玻片背面,直至流出的水無色為止。

復染:用0.5%番紅染液復染1.5min。

水洗:用緩流水洗后,干燥。

鏡檢:先低倍鏡,再高倍鏡,最后油鏡觀察。

1.3 實驗流程圖

圖1 實驗流程圖 Fig.1 Flow diagram of experiment

2 結果與分析

2.1 小麥殺菌前后微生物總量計數結果及分析

按照1.2.4所述的計數方法,不同濃度下,殺菌時間為3h,殺菌前后小麥表面菌落數及殺菌率如下表所示:

表1 殺菌前后菌落數及殺菌率Table 1 Colony count before and after sterilization and sterilization rate

從表1中可以看出,殺菌時間為3h的條件下,隨著二氧化氯氣體濃度的增大,殺菌率逐漸上升,小于2mg/L時殺菌率隨濃度變化的影響較大,在二氧化氯濃度為8mg/L時的殺菌率達到99.90%,到10mg/L時殺菌率為99.91%,無明顯增加趨勢。這是因為在氣體二氧化氯濃度較低時,能殺死小麥表面大部分的細菌,殺菌率的增加趨勢較為明顯;當濃度增大到一定程度以后,絕大部分的細菌被殺死,還有部分抗性較強的細菌,較難殺滅;二氧化氯氣體隨著時間的延長,氣體部分被分解[13],濃度下降,因此,在較低濃度時,殺菌率隨氣體二氧化氯濃度的變化較大,在一定時間內,殺菌率達到一定程度后,隨著濃度的繼續增加,殺菌率基本保持不變,在殺菌時間為3h時,二氧化氯殺菌濃度8mg/L為宜。

2.2 同一濃度下不同殺菌時間對殺菌率的影響

氣體二氧化氯為8mg/L時,為了確定合適的殺菌時間,以殺菌率為主要指標,考察在不同時間條件下,對殺菌率的影響,實驗結果如圖2。

圖2 殺菌時間對殺菌率的影響 Fig.2 The influence of the different sterilization time on sterilization rate

從圖2可知,在60min內,殺菌率隨著殺菌時間的增加明顯增加,殺菌時間達到90min時,殺菌率為99.85%,繼續延長殺菌時間,殺菌率基本保持不變,這是因為在一定時間之內氣體二氧化氯的濃度較大,殺菌率有較明顯的增長趨勢;隨著時間的延長,大部分菌落基本被殺滅,殺菌率基本保持不變,因此在二氧化氯濃度為8mg/L時的殺菌時間90min為宜。

2.3 實驗結果驗證

為了進一步驗證實驗結果的準確性,按照氣體二氧化氯濃度為8mg/L,殺菌時間為90min的條件進行3次重復實驗,實驗結果如表2。

表2 最佳條件下殺菌率Table 2 The sterilization rate under the best condition

圖3為氣體二氧化氯濃度為8mg/L,殺菌時間為90min,小麥樣品殺菌效果照片。

圖3 小麥樣品殺菌前后10-1稀釋液的平板計數圖 Fig.3 The figure of plate count of wheat sample 10-1 diluent before and after sterilization

從圖3中可以明顯看到殺菌前后微生物數量變化情況,小麥樣品的二氧化氯氣體殺菌濃度為8mg/L,殺菌時間為90min,殺菌前10-1稀釋液的一個平板微生物量較多,殺菌后幾乎沒有菌落生長,由此可見,在此條件下具有較佳的殺菌效果,在小麥防霉處理中,殺菌的條件為氣體二氧化氯濃度8mg/L,殺菌時間90min,能得出較佳的殺菌效果。

2.4 不同含水率小麥殺菌效果比較

含水率是小麥加工過程以及產品品質的重要因素,適宜加工的小麥含水率為13%～17%[14]。氣體二氧化氯濃度為8mg/L,殺菌時間為90min時,小麥含水率為8%、13%、15%、17%和20%的殺菌率如圖4所示:

圖4 不同含水率小麥殺菌效果比較 Fig.4 Comparative sterilization effect of wheat with the different moisture content

從圖4中可以看出,隨著小麥含水率的增加,殺菌率逐漸下降,在17%以內時,殺菌率都在99%以上,下降幅度較小,當小麥含水率繼續增加時,殺菌率有較大幅度的減小,因此,在氣體二氧化氯濃度和殺菌時間適當的條件下,二氧化氯對小麥表面的殺菌率會隨著含水率的增加逐漸下降。

2.5 菌種鑒定

2.5.1 菌種提取 采用平板分離法從未殺菌小麥樣品培養基上長出的菌落中分別挑取具有代表性的2種細菌,標記為X1、X2,菌落圖片如圖5所示:

圖5 未殺菌小麥樣品培養基中分離的兩種細菌 Fig.5 Two kinds of bacteria seperated on medium of wheat samples without sterilization

2.5.2 革蘭氏染色實驗結果與分析 革蘭氏染色反應[15]是細菌重要的鑒別特征,革蘭氏染色法將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性,菌體被染成藍紫色的是革蘭氏陽性菌,菌體被染成紅色的是革蘭氏陰性菌。

X1號微生物的革蘭氏染色結果如圖6所示。

圖6 X1革蘭氏染色結果 Fig.6 The result of X1 by gram staining

從圖中可以看出,菌體被染成藍紫色,菌體形態近似球菌,說明X1號菌為革蘭氏陽性菌。

X2號微生物的革蘭氏染色結果如圖7所示。

圖7 X2革蘭氏染色結果 Fig.7 The result of X2 by gram staining

從圖7中可看出,菌體被染成紅色,菌體形態為桿菌,說明X2號菌為革蘭氏陰性菌。

2.3 芽孢染色實驗結果與分析

芽孢是芽孢桿菌屬和梭菌屬生長到一定階段形成的一種抗逆性很強的休眠體結構,通常為圓形或橢圓形,根據芽孢染色結果判斷菌體有無芽孢[16]。

根據油鏡觀察芽孢是否呈綠色,如圖8所示,X1號菌無芽孢;X2號菌無芽孢。

圖8 芽孢染色結果 Fig.8 The result of X1(left)and X2(right)spore staining

從圖8中的兩種菌的染色結果來看,即X1號菌為革蘭氏陽性菌,菌體形態為球狀,無芽孢;X2號菌為革蘭氏陰性菌,菌體形態為桿狀,無芽孢。

3 結論

在對小麥表面細菌殺菌過程中,隨著氣體二氧化氯濃度的增大,殺菌率也增大,一定時間內,二氧化氯濃度成為影響小麥殺菌效果的主要因素,其次是殺菌時間。殺菌時間90min,氣體二氧化氯濃度為8mg/L的條件下,對小麥的一次殺菌率達到99.90%,可作為小麥防霉處理的最佳條件。菌落鑒定結果表明,小麥表面的菌落,主要為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌,沒有芽孢生長。

[1]程芳. 小麥和玉米儲藏期間微生物多樣性變化及控制[D].濟南:山東農業大學食品科學與工程學院,2012.

[2]楊學明,姚金寶,馬鴻翔,等. 殺菌劑對弱筋小麥9號品質和產量的影響[J].江蘇農業學報,2012,28(4):709-712.

[3]胡文忠,姜愛麗,田中俊一郎. 紅外線照射谷物表面殺菌的研究[J]. 食品與機械,2007,23(4):8-11.

[4]Hamanaka D,Dokan S,Yasunaga E,etal. The sterilization effects of infrared ray on the agricultural products spoirage microorganisms. 2000 ASAE Annual International Meeting,Technical Papers:Engineering Solutions for a New Century[C]. 2000:971-979.

[5]晏暉. 三唑酮、福美雙復配包衣對春小麥病害的作用效果[J]. 種子,2002,3:35-36.

[6]Ri Ya Jin,Shuang Qi Hu,Ying Hao Zhang,etal. Research on the explosion characteristics of chlorine dioxide gas[J]. Chinese Chemical Letters,2008,19:1375-1378.

[7]韋明肯,賴潔玲,詹萍. 二氧化氯殺菌機理研究進展[J]. 微生物學報,2012,52(4):429-434.

[8]晉日亞,胡雙啟. 氣體二氧化氯對蘋果表面細菌殺菌規律研究[J]. 食品科學,2008,29(7):109-112.

[9]申小靜,胡雙啟. 氣體二氧化氯對鮮棗表面青霉菌的殺滅效果研究[J]. 食品工業科技,2010,31(6):301-302.

[10]奚小艷. 氣體二氧化氯對公共場所空間環境消毒效果研究[D]. 太原:中北大學化工與環境學院,2012.

[11]GB_4789.2-2010,食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定[S].

[12]周群英,王士芬. 環境工程微生物學[M]. 北京:高等教育出版社出版,2008.

[13]崔超,胡雙啟,晉日亞,等. 氣體二氧化氯的光解規律研究[J]. 中國安全科學學報,2011,21(7):53-55.

[14]張克平,黃建龍,楊敏,等. 冬小麥籽粒受擠壓特性的有限元分析及實驗驗證[J]. 農業工程學報,2010,26(6):352-355.

[15]洪慶華,遲杰,齊云,等. 影響革蘭氏染色結果的原因分析[J]. 實驗技術與管理,2011,28(5):41-43.

[16]張俊會,馬國芳. 光學顯微鏡下細菌芽孢染色方法的探討[J]. 生物學雜志,2011,28(6):106-108.