青藏高原自然發酵牦牛酸奶中乳酸菌的抗氧化能力的研究

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(1.西南大學食品科學學院,重慶 400715;2.重慶第二師范學院生物與化學工程系,食品安全與營養研究所,重慶 400067)

生物氧化作用對生物有機體而言是一個重要的生理過程,但當機體受到外界環境的不利影響或出現病變時,就會導致體內的活性氧(ROS)及其它自由基不能被有效地清除,影響細胞活性,對機體產生毒害,最終導致衰老、腫瘤等病癥[1-2]。因此為了更好的加強機體的抗氧化能力,且從食品安全性上考慮,開發天然抗氧化劑具有非常重要的意義,現已成為當今研究熱點[3]。近年來,一些發酵乳制品,因為具有獨特的口感和較強的抗氧化活性而受到越來越多人的關注[4],而經過體內外實驗證明,部分乳酸菌具有良好的抗氧化活性,如黃珊珊等[5]研究發現植物乳桿菌的抗氧化活性優于保加利亞乳桿菌。張江魏等[6]通過抗亞油酸過氧化能力和清除DPPH自由基實驗,從30株乳酸菌中篩選出抗氧化活性較強的2種乳酸菌株。Lin等[7-8]研究了嗜酸乳桿菌清除羥自由基和抗脂質過氧化的能力。Verena等[9]研究發現服用含有一定劑量乳酸菌的牛乳后乳酸菌可以保護腸道細胞DNA免受氧化損傷。青藏高原自然發酵牦牛酸奶作為藏區人民特色食品和生活必需品,以其豐富的營養,獨特的風味和抗氧化、調節機體免疫能力等保健功能,受到了越來越多的人的關注[10]。研究表明,牦牛酸奶的保健功能與其中含有的優勢乳酸菌有密切的關系,這些乳酸菌具有抑菌、增強機體免疫力、抗衰老和抗癌等生理功能。因此,無論從營養保健還是安全性方面考慮,牦牛酸奶中的乳酸菌作為天然抗氧化物質吸引了眾多學者的研究興趣,成為近年來食品研究的新興領域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株 將本實驗室采至從西藏及川西青藏高原牧民家庭的10份自然發酵牦牛酸奶中分離純化得到的15株乳酸菌菌株,編號為:La1～La15;MRS培養基、脫脂乳培養基:北京索萊寶生物科技有限公司;PBS緩沖液(pH7.4)、Tris-HCl(pH8.2)、氫氧化鈉、過氧化氫(H2O2)、過氧化氫酶、抗壞血酸、三氯甲烷、鄰苯三酚、二乙三胺五乙酸、硫酸亞鐵(FeSO4)、硫代巴比妥酸(TBA)、O-菲羅啉、三氯乙酸(TCA)、亞油酸、亞油酸乳化液、二苯代苦味肼基自由基(DPPH)等試劑均為國產分析純。

紫外可見分光光度計-2450 SHIMADZU日本島津公司;高壓滅菌鍋 上海三申醫療器械廠;SW-CJ-IFD型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;DHG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠;筆型pH計 上海宇隆儀器有限公司;HZ-9211K恒溫振蕩器 太倉市科教器材廠;臺式冷凍離心機 美國SIGMA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌株的活化培養 將15株已純化保存的乳酸菌株樣品分別接種于脫脂乳培養基中,置30℃活化培養24h,然后劃線接種于MRS平板,30℃培養48h。

1.2.2 乳酸菌無細胞提取物的制備 分別挑取活化后的15株乳酸菌株于MRS液體培養基30℃培養24h,發酵液于4000×g離心15min,收集菌體,并用PBS(pH7.4)緩沖液洗滌3次,將菌數調整為1010cfu/mL,重懸于PBS中,在冰浴中超聲波破碎菌體,破碎液于4℃,12000×g離心30min,取上清液,即為所需待測樣品[6,11]。

1.2.3 乳酸菌抗氧化活性的檢測

1.2.3.1 對H2O2的耐受能力的實驗 將活化后的菌株離心收集菌體,用PBS緩沖液洗滌,制備成108cfu/mL的菌液,在5mL H2O2濃度為0%、0.2%、0.3%、0.5%、1%的PBS溶液中分別加入0.5mL菌液,37℃處理1min,再分別加入0.2mg/mL過氧化氫酶;涂布于MRS固體培養基,30℃培養48h,計數并計算其存活率[6,11],并重復實驗3 次。

存活率(%)=(AX-APBS)/(A0-APBS)×100

式中:AX為各濃度H2O2時計數結果;APBS為PBS計數結果;A0為不加H2O2時計數結果。

清除率(%)=[1-(A11-A10)/(A01-A00)]×100

式中:A11為含樣品和鄰苯三酚;A10為含樣品,不含鄰苯三酚;A00為不含樣品和鄰苯三酚;A01為不含樣品,含鄰苯三酚。

1.2.3.3 螯合Fe2+能力的實驗 參照文獻[12]中的方法,略有改進(空白對照為PBS):在0.5mL乳酸菌無細胞提取物中依次加入1%的抗壞血酸0.1mL,0.4%的FeSO40.1mL和0.2mol/L的NaOH 1mL;將混合液在30℃水浴20min,三氯乙酸沉淀蛋白,于4℃ 4500g/min離心10min;取上清液0.2mL,加入0.1%的O-菲羅啉(質量分數)2mL,反應10min,記錄其在510nm波長處的吸光值(A),并重復實驗3次。

1.2.3.4 抗脂質過氧化能力的實驗 參照文獻[12],用硫代巴比妥酸(TBA)法,通過檢測脂質過氧化反應的最終產物丙二醛(MDA)的含量從而得知脂質過氧化的情況,這是目前公認的反映脂質過氧化的指標[13-15]。MDA在酸性條件下可以與TBA發生反應生成3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮,在532nm波長處有吸收峰,且吸收程度與抗氧化活性呈線性關系,通過下面的公式計算出抗脂質過氧化率(空白對照為PBS),并重復實驗3次。

抗脂質過氧化率(%)=[1-A(樣品)/A(空白)]×100

1.2.3.5 清除DPPH自由基能力的實驗 參照文獻[6,12]的方法,略作改動如下:取1mL乳酸菌無細胞提取物,加入1mL 0.2mmol/L的DPPH自由基甲醇溶液,室溫、黑暗中反應30min;用三氯甲烷抽提反應液,記錄其在517nm波長處的吸光值(A),并重復實驗3次。

DPPH自由基清除率(%)=[1-A(樣品)/A(空白)]×100

式中:A(空白):空白對照為去離子水。

1.3 實驗數據處理方法

實驗數據分析采用IBM SPSS 19.0軟件,所有實驗數據均表示為平均值±SD值,差異顯著性分析采用一維方差分析(One-Way ANOVA),顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 對H2O2的耐受能力實驗

以0% H2O2中乳酸菌的存活率為100%計算。如圖1所示,15株乳酸菌均對H2O2有不同程度的耐受能力。當H2O2濃度為0.2%時,乳酸菌的存活率為85%～94%之間,最高為菌株La2,達到93.5%,菌株La1和 La10的存活率也均超過93%。當H2O2濃度為0.3%時,乳酸菌的存活率為70%～85%之間,最高為菌株La5,菌株La10和La1的存活率也均超過84%。當H2O2濃度為0.5%時,乳酸菌的存活率45%～66%之間,最高為菌株La15,達到65.2%,菌株La1和La5的存活率也均超過62%。當H2O2濃度達到1%時,乳酸菌的存活率為10%～33%之間。其中菌株La15存活率最高,達到32.9%;其次為菌株La6,達到30.6%;菌株La4、La10和La11也顯示了較高的耐受能力,乳酸菌的存活率分別達到了27.8%、25.9%和25.4%。

圖1 乳酸菌在不同濃度H2O2中的存活率(n=3) Fig.1 Survival of Lactobacillus in different concentrations of H2O2(n=3)

實驗數據表明,15株乳酸菌的存活率均隨著H2O2濃度的增高而減低;當H2O2濃度達到1%時,乳酸菌的存活率較高的菌株為La15、La6、La4、La10和La11這五株菌。

2.2 清除超氧自由基的能力實驗

圖2 乳酸菌無細胞提取物的清除超氧自由基的能力(n=3) Fig.2 Scavenging rates of cell-free extracts of Lactobacillus against superoxide anion free radicals(n=3)

2.3 螯合Fe2+能力的實驗

由圖3可知,15株乳酸菌均對Fe2+有一定的螯合能力,每1010個乳酸菌的無細胞提取物可螯合Fe2+的量在5.3×10-6～62.7×10-6。其中螯合能力較高的有3株菌,分別為La3、La10和La11,其中螯合能力最強的為La10,達62.7×10-6。

圖3 乳酸菌無細胞提取物的螯合Fe2+能力(n=3) Fig.3 The ability of Fe2+ chelating of cell-free extracts of Lactobacillus(n=3)

機體內許多氧化過程都需要銅、鐵等金屬離子的參與,故這些過渡金屬離子是導致氧化損傷的一種重要原因。當金屬離子被螯合后,便不能啟動多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化,從而減緩了脂類化合物氧化的速度,阻止其對機體生物膜和核酸的傷害。因此,對Fe2+的螯合能力對抑制氧化具有非常重要的意義。

實驗數據表明,La3、La10和La11這三株乳酸菌對Fe2+的螯合能力優于其他菌株,具有更強的抗氧化能力。這與Kai等[17]研究乳酸菌對腸黏膜的抗氧化作用時發現的乳酸菌菌株通過減少金屬離子和脂質過氧化作用來提高整體抗氧化水平的,Lee等研究發現乳酸菌的抗氧化效果是通過螯合銅離子和亞鐵離子來實現的[18]是一致的。

2.4 抗脂質過氧化能力的實驗

由圖4可知,在抗亞油酸過氧化實驗中,15株乳酸菌對亞油酸過氧化均有不同程度的抑制作用,抑制率的范圍在5%～71%之間。其中抑制率較高的有三株菌,分別是La3、La10和La11,其中La3的抑制率最高,達到70.8%。

圖4 乳酸菌無細胞提取物的抗脂質過氧化的能力(n=3) Fig.4 The ability of anti-lipid peroxidation of cell-free extracts of Lactobacillus(n=3)

自由基攻擊細胞膜上的多聚不飽和脂肪酸而觸發脂質過氧化等一系列鏈式反應叫脂質過氧化反應。脂質過氧化反應在機體的新陳代謝過程中起著重要的作用,如果失調,就會引起氧自由基連鎖反應,損害機體的生物膜及其功能,使細胞發生病變及纖維化,造成機體神經、組織、器官等損傷。

實驗數據表明,La3、La10和La11這三株乳酸菌的抗脂質過氧化的能力優于其他菌株,具有更強的抗氧化能力。

2.5 清除DPPH自由基能力的實驗

由圖5可知,15株乳酸菌對DPPH自由基均有一定的清除作用,清除率的范圍在8%～49%之間。其中清除率較高的有3株菌,分別是La3、La10和La11,清除率最高的是La10,達到48.6%。

圖5 乳酸菌無細胞提取物清除DPPH自由基的能力(n=3) Fig.5 Scavenging rates of cell-free extracts of Lactobacillus against DPPH free radicals(n=3)

DPPH自由基是一種以氮為中心的,很穩定的自由基,乳酸菌能清除它,說明其具有降低羥基等自由基和打斷脂質過氧化鏈反應的作用。通過檢測乳酸菌對DPPH自由基清除能力的高低可以表示其抗氧化能力的強弱[19]。

實驗數據表明,La3、La10和La11這三株乳酸菌的對DPPH自由基清除能力優于其他菌株,具有更強的抗氧化能力。

3 結論

在本研究的基礎上,我們準備將篩選出的菌株La3、La10和La11做體內抗氧化實驗,進一步驗證其抗氧化能力,為合理利用開發乳酸菌抗氧化制劑提供理論參考。

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