發(fā)酵條件對梨醋釀造過程中有機酸的影響

, ,

(1.河北科技大學生物科學與工程學院,河北石家莊 050018;2.河北省農林科學院遺傳生理研究所,河北石家莊 050051)

果醋是以水果為主要原料,經酒精、醋酸兩個階段發(fā)酵釀制而成的營養(yǎng)豐富、風味獨特的酸性保健飲品[1-2]。果醋的酸味決定于其有機酸的構成和含量,而有機酸的構成和含量決定了果醋的酸感與風味特點,進而影響果醋的感官品質。蘋果酸酸味爽快柔和、刺激性緩慢、保留時間較長;檸檬酸酸味爽口,其酸度比蘋果酸高,人的味覺更易感知;奎寧酸和莽草酸則可產生苦味[3];醋酸具有較強的刺激性,而檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸可緩沖醋酸的刺激性,使酸味柔和、醇厚[4-5]。這些有機酸共同決定了果醋的酸感。梨汁本身含有蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、奎寧酸、莽草酸、乳酸等多種有機酸[6-7]。釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中不僅會將糖轉化為酒精,而且在其生長代謝過程還會產生蘋果酸和琥珀酸等有機酸[8]。醋酸菌在蘋果醋醋酸發(fā)酵過程中代謝消耗蘋果酸、乳酸、琥珀酸,而產生和積累檸檬酸[9]。國內對梨醋的釀造工藝進行了許多研究,然而,有關梨醋釀造過程中有機酸變化的研究卻報道很少。本文以河北特產鴨梨為原料釀制成梨醋,采用反相高效液相色譜(HPLC),分析研究了酒精發(fā)酵階段和醋酸發(fā)酵階段發(fā)酵條件對梨酒和梨醋有機酸的影響,以期為梨醋釀造的工藝優(yōu)化及酸感質量評價提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鴨梨 河北省趙縣產;安琪釀酒酵母(約220億個/g) 湖北安琪酵母股份有限公司;釀酒酵母1416、33133、1253、31009 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;滬釀1.01醋酸菌 石家莊珍極釀造集團;巴氏醋酸菌 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;醋酸菌SG19、SG20 本實驗室自篩;草酸、蘋果酸、檸檬酸、乳酸 天津市風船化學試劑科技有限公司,分析純;酒石酸 天津市博迪化工有限公司,分析純;奎寧酸、琥珀酸、莽草酸 上海源葉生物科技公司,分析純。

JYZ-E6螺桿式榨汁機 九陽股份有限公司;SPX-250B-II型生化培養(yǎng)箱 上海賀德實驗設備廠;LG16-B型高速離心機 北京雷勃爾設備有限公司;LC-20AT液相色譜儀,配有紫外檢測器、在線脫氣機和色譜柱恒溫箱 島津企業(yè)管理(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 梨汁的制備 選擇新鮮無病的成熟鴨梨,清水洗凈、去核后,用螺桿式榨汁機榨汁。采用阿貝折光儀測得梨汁的糖度為11.2%。

1.2.2 酒精發(fā)酵

1.2.2.1 安琪釀酒酵母的活化 配制5%的葡萄糖水,以100∶1(v/w)比例加入安琪干酵母,35℃活化40min。

1.2.2.2 釀酒酵母種子培養(yǎng)基 2%葡萄糖,0.5%酵母粉,0.3%蛋白胨,0.2% KH2PO4,0.2%(NH4)2SO4,pH 5.0。

1.2.2.3 釀酒酵母種子液的制備 在100mL釀酒酵母菌種子培養(yǎng)基中,分別接入2～3環(huán)斜面保藏的釀酒酵母1416、33133、1253、31009,30℃、180r/min 搖床培養(yǎng)2d。

1.2.2.4 酒精發(fā)酵 將150mL梨汁加入250mL的三角瓶中,并按10%接種量接入釀酒酵母種子液,用8層干凈的紗布封口,在生化培養(yǎng)箱靜置進行酒精發(fā)酵,并采用阿貝折光儀監(jiān)測發(fā)酵液糖度。當糖度不再明顯降低,終止酒精發(fā)酵。

1.2.3 醋酸發(fā)酵

1.2.3.1 醋酸菌種子培養(yǎng)基 5%(v/v)無水乙醇、1%葡萄糖、1%酵母粉、0.2%(NH4)2SO4、0.2% KH2PO4、0.2% MgSO4。

1.2.3.2 醋酸菌種子液的制備 將2～3環(huán)斜面保藏的滬釀1.01、巴氏醋酸菌、醋酸菌SG19和SG20,分別接種到100mL醋酸種子培養(yǎng)基中,30℃、180r/min 搖床培養(yǎng)2d。

1.2.3.3 醋酸發(fā)酵 酒精發(fā)酵結束后,5000r/min離心10min除去酵母菌體和果肉殘渣。按10%接種量接入醋酸菌種子液進行靜置醋酸發(fā)酵,并采用酸堿滴定法監(jiān)測發(fā)酵液的酸度。直到酸度不再明顯升高,終止醋酸發(fā)酵。

1.2.4 釀酒酵母種類對梨酒有機酸的影響 在150mL梨汁中,按10%接種量分別接入安琪酵母、釀酒酵母1416、33133、1253、31009種子液,28℃下靜置進行酒精發(fā)酵。

1.2.5 發(fā)酵溫度對梨酒有機酸的影響 按10%接種量向150mL梨汁中接入釀酒酵母1416種子液,分別在25、28、30、34℃下進行靜置酒精發(fā)酵。

1.2.6 醋酸菌種類對梨醋有機酸的影響 150mL梨汁中,按10%接入釀酒酵母1416種子液,28℃靜置發(fā)酵3d。酒精發(fā)酵結束后,5000r/min離心10min,制得澄清梨酒(酒精含量3.86%)。在120mL梨酒中按8%接種量分別接入滬釀1.01、巴氏醋酸菌、醋酸菌SG19和醋酸菌SG20種子液,30℃下進行表面靜置醋酸發(fā)酵。

1.2.7 醋酸發(fā)酵溫度對梨醋有機酸的影響 在120mL梨酒中按8%接種量接入滬釀1.01醋酸菌種子液,分別在25、30、34、37℃下進行表面靜置醋酸發(fā)酵。

1.2.8 醋酸發(fā)酵方式對梨醋有機酸的影響 在120mL梨酒中按8%接種量接入滬釀1.01醋酸菌種子液,在30℃下分別進行表面靜置醋酸發(fā)酵(10d)和搖床深層醋酸發(fā)酵(120r/min、8d)。

1.3 有機酸的測定

1.3.1 色譜條件 色譜柱:Inertsil ODS-SP C18色譜柱(4.6mm×250mm);流動相:0.01mol/L KH2PO4溶液,pH2.55(用50%的H3PO4調節(jié));流速:0.50mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:210nm;進樣量:20μL/次。

1.3.2 標準溶液的配制 分別準確(精確至0.0001g)稱取0.2g草酸、1.0g酒石酸、5.0g蘋果酸、1.0g莽草酸、5.0g乳酸、6.0g乙酸、3.0g檸檬酸、8.0g琥珀酸、0.1g奎寧酸,用三蒸水溶解并定容至100mL,制備得到有機酸的標準儲備液。上述溶液配制成不同濃度的混合標準液,用0.22μm濾膜過濾后,上機繪制9種有機酸的標準曲線。

1.3.3 樣品預處理 取5mL梨酒或梨醋,8000r/min離心10min,得到上清液。用三蒸水稀釋合適倍數后經0.22μm膜濾后進行HPLC測定。

1.3.4 有機酸定性定量方法 樣品以保留時間和各有機酸紫外吸收光譜來定性,以峰面積外標法定量。每個樣品重復3次,取其平均值。

2 結果與分析

2.1 鴨梨汁中的有機酸

為了研究鴨梨醋釀造過程中有機酸的變化,采用HPLC測定了鴨梨汁中9種有機酸,分析結果見表1。鴨梨汁中含有豐富的有機酸,其中含量最高的為蘋果酸,占總酸含量的52.2%;其次為草酸和奎寧酸,分別占總酸含量的18.6%和10.9%;而檸檬酸含量較少。高海燕等人[7]也測定了河北鴨梨汁中的有機酸,發(fā)現(xiàn)鴨梨汁中主要有機酸含量依次為:蘋果酸﹥檸檬酸﹥奎寧酸,這與本實驗的結果不完全一致,造成這種差異的原因是由于土壤、栽培管理、果實成熟度等條件的不同。

2.2 酒精發(fā)酵階段發(fā)酵條件對梨酒中的有機酸的影響

2.2.1 釀酒酵母種類對梨酒有機酸的影響 為了考察釀酒酵母種類對梨酒中有機酸的影響,本實驗使用了安琪酵母、釀酒酵母1416、33133、1253、31009釀酒酵母來釀制梨酒,并測定了其中9種有機酸的含量,分析結果見表2。

表1 鴨梨汁中有機酸的含量(mg/100mL)Table 1 The contents of organic acids in Ya’ pear juice(mg/100mL)

表2 不同釀酒酵母釀制梨酒中有機酸的含量(mg/100mL)Table 2 The contents of organic acids in perry fermented with different yeasts(mg/100mL)

由表2可見,同發(fā)酵前(鴨梨汁)相比,梨酒中的草酸、奎寧酸含量均表現(xiàn)為下降,乳酸、琥珀酸含量則均表現(xiàn)為上升,這表明5種釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中,代謝消耗了部分草酸和奎寧酸,同時產生乳酸和琥珀酸。在葡萄酒的酒精發(fā)酵過程中,酵母菌也會產生乳酸和琥珀酸[10]。其它5種有機酸變化因釀酒酵母種類的不同而有很大差別。例如,釀酒酵母1416、31009和安琪釀酒酵母均產生大量的乙酸,而釀酒酵母1253卻不產生乙酸;釀酒酵母31009會大量利用消耗蘋果酸,而釀酒酵母1253卻可少量合成蘋果酸。在葡萄酒釀造過程中,也發(fā)現(xiàn)蘋果酸既可被酵母代謝,又可被合成[11]。由于使用的釀酒酵母的不同,造成所釀制的梨酒中主要有機酸(含量>100mg/100mL)種類也不同。例如,釀酒酵母1253釀制梨酒的主要有機酸為蘋果酸,與鴨梨汁的相同,而釀酒酵母31009釀制梨酒的主要有機酸為乙酸。

從表2還可見,僅有釀酒酵母1416使得酒精發(fā)酵后的有機酸總量顯著增加,造成這種現(xiàn)象的主要原因是釀酒酵母1416大量產生乙酸,達到了363.74mg/100mL;安琪釀酒酵母、釀酒酵母1253、釀酒酵母31009卻使得梨酒中的有機酸顯著減少,其原因是草酸、奎寧酸、莽草酸及蘋果酸(釀酒酵母1253例外)大幅度減少;對于釀酒酵母33133而言,梨酒中的有機酸總量幾乎保持不變,而這種不變實際是幾種有機酸漲消平衡的結果。由此可見,釀酒酵母的種類對梨酒中有機酸含量有著很大的影響。選擇使用酸感良好的釀酒酵母,對于獲得風味優(yōu)良的高品質梨醋是非常重要的。在酒精發(fā)酵過程中,釀酒酵母1416在產生酒精的同時還產生較多的有機酸,而且其中主要是乙酸(56.0%)和蘋果酸(18.2%)。故從梨醋生產的角度考慮,1416為較適宜的釀酒酵母。

2.2.2 發(fā)酵溫度對梨酒有機酸的影響 發(fā)酵溫度是影響釀酒酵母生長和產生酒精的重要影響因素之一。酒精發(fā)酵溫度對梨酒中9種有機酸的影響分別見圖1和圖2。

圖1 酒精發(fā)酵溫度對梨酒有機酸的影響 Fig.1 Effect of ethanol fermentation temperature on organic acids in perry

圖2 酒精發(fā)酵溫度對梨酒有機酸的影響 Fig.2 Effect of ethanol fermentation temperature on organic acids in perry

如圖1、圖2所示,梨酒中乙酸、琥珀酸隨著酒精發(fā)酵溫度的升高而增加,尤其是乙酸,當發(fā)酵溫度從25℃升高到34℃時,乙酸含量從70.13mg/100mL增加到482.0mg/100mL,增加了5倍多;而蘋果酸、乳酸、奎寧酸含量則隨著酒精發(fā)酵溫度的增加而降低。蘋果酸含量的降低是由于部分蘋果酸轉化成了琥珀酸[10]。酒石酸、檸檬酸含量分別在28、30℃下達到最高值,隨著溫度的進一步增加,其含量降低。發(fā)酵溫度對梨酒的莽草酸、草酸含量影響很小。在實驗中發(fā)現(xiàn),當發(fā)酵溫度為34℃時,梨酒在12h之內出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象,發(fā)酵結束后的風味明顯不如低溫的。造成這一現(xiàn)象的原因,可能是因為30℃以上的高溫發(fā)酵容易使酵母生長繁殖過快,過多的消耗了梨汁的營養(yǎng)成分,導致梨酒果香味淡薄[12]。上述結果表明,酒精發(fā)酵溫度對梨酒中有機酸的代謝和合成有著顯著影響,因此,在選擇酒精發(fā)酵溫度時,不僅要考慮發(fā)酵溫度對酒精發(fā)酵效率的影響,還要考慮對有機酸變化以及由此產生的對梨酒風味的影響。從梨酒風味角度考慮,28℃為適宜酒精發(fā)酵溫度。

2.3 醋酸發(fā)酵階段發(fā)酵條件對梨酒中的有機酸的影響

2.3.1 醋酸菌種類對梨醋有機酸的影響 在梨酒中分別接種滬釀1.01、巴氏醋酸菌、醋酸菌SG19和SG20,30℃下進行表面靜置醋酸發(fā)酵,實驗結果見表3。

表3 不同醋酸菌釀造梨醋中有機酸的含量(mg/100mL)Table 3 The contents of organic acids in pear vinegar fermented with different acetic acid bacteria(mg/100mL)

如表3所示,4種醋酸菌均大量產生乙酸,乙酸含量占總酸比例均達到80%以上,特別是滬釀1.01氧化乙醇產生乙酸能力很強,其產酸量比其它3個菌種高一倍以上,這是由于滬釀1.01是一個米醋工業(yè)生產上使用的菌種。與梨酒中的有機酸相比,4種醋酸菌均使得梨醋中酒石酸含量增加,而使得檸檬酸含量降低,說明4種醋酸菌均有代謝酒石酸和檸檬酸的能力,醋酸發(fā)酵過程中消耗檸檬酸,而產生和積累酒石酸。除乙酸、酒石酸和檸檬酸外,梨醋中的有機酸變化因使用的醋酸菌而異。例如,巴氏醋酸菌、醋酸菌SG19和醋酸菌SG20在醋酸發(fā)酵期間顯著地消耗了部分蘋果酸,而滬釀1.01醋酸菌卻產生一些蘋果酸;滬釀1.01、巴氏醋酸菌和醋酸菌SG20可產生部分奎寧酸,而醋酸菌SG19卻將梨酒中奎寧酸代謝殆盡。梨醋中主要有機酸也因使用的醋酸菌而異,例如,滬釀1.01梨醋的主要有機酸依次為:乙酸>蘋果酸>奎寧酸>酒石酸,而巴氏醋酸菌梨醋主要有機酸依次為:乙酸>酒石酸>蘋果酸>奎寧酸。醋酸發(fā)酵結束后,滬釀1.01發(fā)酵液總酸達到2348.4mg/100mL,有明顯的醋酸味,而其它3種醋酸菌發(fā)酵液由于總酸較少,醋酸味較淡,梨醋的品質較差。由上述可知,醋酸菌的種類對梨醋中有機酸的代謝有顯著影響。

2.3.2 醋酸發(fā)酵溫度對梨醋有機酸的影響 為了了解發(fā)酵溫度對梨醋釀制過程中有機酸產生的影響,在梨酒中接種滬釀1.01醋酸菌,分別在25、30、34、37℃下進行表面靜置醋酸發(fā)酵,實驗結果見圖3和圖4。

圖3 醋酸發(fā)酵溫度對梨醋有機酸的影響 Fig.3 Effect of acetic fermentation temperature on organic acids in pear vinegar

圖4 醋酸發(fā)酵溫度對梨醋有機酸的影響 Fig.4 Effect of acetic fermentation temperature on organic acids in pear vinegar

作為梨醋中最主要的有機酸,乙酸含量在25～34℃范圍內隨著發(fā)酵溫度的上升而增加;當發(fā)酵溫度超過34℃時,梨醋乙酸含量明顯下降,這是由于醋酸發(fā)酵溫度過高時菌體老化加快,產酸量降低[13]。酒石酸、奎寧酸、莽草酸、琥珀酸和乳酸含量隨著發(fā)酵溫度的升高而增加,但增幅不一。在較低(25℃)或較高(37℃)發(fā)酵溫度下有利于檸檬酸的產生。蘋果酸和草酸的含量受發(fā)酵溫度影響很小。

2.3.3 醋酸發(fā)酵方式對梨醋有機酸的影響 將滬釀1.01醋酸菌接種在梨酒中,分別進行表面靜置醋酸發(fā)酵和搖床深層醋酸發(fā)酵,實驗結果見表4。從表4中可發(fā)現(xiàn),搖床深層發(fā)酵釀制梨醋的總酸要高于表面靜置發(fā)酵,其有機酸含量差別及對梨醋酸感的影響主要體現(xiàn)在乙酸和蘋果酸上。搖床深層發(fā)酵產生的乙酸顯著高于表面靜置發(fā)酵,其原因是醋酸發(fā)酵是一個好氧發(fā)酵過程,搖床深層發(fā)酵可提供比表面靜置發(fā)酵更多的氧氣,而較充足的氧氣供給更有利于乙醇的轉化。從表4中還可發(fā)現(xiàn),表面靜置發(fā)酵會使得滬釀1.01合成部分蘋果酸,與之相反,搖床深層發(fā)酵卻會造成大量蘋果酸的消耗;蘋果酸酸味爽快柔和,這可能是導致靜置發(fā)酵梨醋風味好于搖床發(fā)酵的原因之一。陳義倫等[9]研究了醋酸發(fā)酵方式對蘋果醋中有機酸的影響,發(fā)現(xiàn)靜置發(fā)酵釀制蘋果醋中蘋果酸僅略高于搖床發(fā)酵,且發(fā)酵方式對酸種類和含量影響不大,與本研究的結果不太一致,其原因可能是由于所使用的釀造原料及醋酸菌的不同。

表4 不同發(fā)酵方式釀造梨醋中有機酸的含量(mg/100mL)Table 4 The contents of organic acids in pear vinegar brewed in different fermentation process(mg/100mL)

3 結論

以河北特產鴨梨為原料釀制成梨醋,采用反相HPLC分析研究了酒精發(fā)酵階段和醋酸發(fā)酵階段發(fā)酵條件對梨酒和梨醋有機酸的影響,研究結果表明:

a.釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中,可代謝梨汁中各種有機酸。與梨汁相比,梨酒中的草酸、奎寧酸含量均表現(xiàn)為下降,乳酸、琥珀酸含量則均表現(xiàn)為上升。梨酒中主要有機酸含量因釀酒酵母種類的不同而有很大差別。

b.梨酒中乙酸、琥珀酸隨著酒精發(fā)酵溫度的升高而增加,而蘋果酸、乳酸、奎寧酸含量則隨著酒精發(fā)酵溫度的升高而降低。發(fā)酵溫度對梨酒的莽草酸、草酸含量影響很小。

c.實驗使用的4種醋酸菌轉化乙醇生成乙酸的能力相差較大。4種醋酸菌均具有代謝各種有機酸的功能,在醋酸發(fā)酵過程中消耗檸檬酸,而產生和積累酒石酸。

d.滬釀1.01醋酸菌的最適產乙酸溫度為34℃。梨醋中酒石酸、奎寧酸、莽草酸、琥珀酸和乳酸含量隨著發(fā)酵溫度的升高而增加。梨醋中蘋果酸和草酸的含量幾乎不受發(fā)酵溫度的影響。

e.發(fā)酵方式影響乙酸的產生及有機酸的代謝。搖床深層發(fā)酵釀制梨醋的總酸要高于表面靜置發(fā)酵,其有機酸含量差別及對梨醋酸感的影響主要體現(xiàn)在乙酸和蘋果酸上。表面靜置發(fā)酵梨醋的蘋果酸含量明顯高于搖床深層發(fā)酵。

[1]霍川,劉青青.我國果醋的研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景[J]. 安徽農業(yè)科學,2012,40(29):14470-14472.

[2]許超群,王亞利,黃從軍,等.蘋果醋的開發(fā)與研究綜述[J].中國調味品,2011,36(2):7-10.

[3]沙守峰,張紹鈴,李俊才. 梨果實有機酸代謝研究進展[J].河北林果研究,2011,1(26):69-71.

[4]包啟安. 食醋科學與技術[M]. 北京:科學普及出版社,1999.

[5]包啟安. 食醋風味探索[J]. 上海調味品,1995,4:1-14.

[6]Li J,Wang Z F,Zhang Z H,etal. Chemical compositional characterization of eight pear cultivars grown in China[J]. Food Chemistry,2007,104:268-275.

[7]高海燕,王善廣,廖小軍,等.不同品種梨汁中糖和有機酸含量測定及相關性分析[J]. 華北農學報,2004,19(2):104-107.

[8]董霞,李崎,顧國賢. 啤酒有機酸類物質研究進展[J],釀酒,2003,30(6):63-65.

[9]陳義倫,裘立群,陳偉,等.原汁蘋果醋中的有機酸[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(8):92-95.

[10]吳佳莉,周廣麒. 葡萄酒釀造中有機酸的含量[J]. 大連輕工業(yè)學院學報,2006,25(1):36-38.

[11]高年發(fā),李小剛,楊楓. 葡萄酒的降酸研究[J].中國食品學報,1999,3(2):16-21.

[12]張秀玲,江連洲,孫佳平,等.黑加侖果酒釀酒酵母發(fā)酵性能研究[J],食品科學,2008,29(12):435-438.

[13]劉浩強,韓林,張鐵濤,等.蘋果醋工藝的實驗研究[J].食品研究與開發(fā),2004,25(2):67-70.