產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑菌株篩選 及固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

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(1.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心(北京工商大學(xué)),北京 100048;2.北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室,北京 100048;3.中糧營養(yǎng)健康研究院,北京 100020; 4.山東龍力生物科技股份有限公司,山東禹城 251022)

α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-glucosidase inhibitor,AGI)作為一種強的餐后血糖抑制劑,對II型糖尿病的預(yù)防表現(xiàn)出良好的生物活性[1]。其化學(xué)結(jié)構(gòu)通常與單糖或寡糖的結(jié)構(gòu)類似,通過競爭性抑制方式來抑制碳水化合物水解酶的活性。此外,α-葡萄糖苷酶抑制劑還能抑制蛋白及脂類糖基化[2],具有抗癌、抗HIV病毒、抗鼠白血病病毒、抗動脈粥樣硬化等作用[1,3]。隨著人們對α-葡萄糖苷酶抑制劑的認識不斷深入,一些含α-葡萄糖苷酶抑制劑的食品已被研究者及糖尿病消費者所認可,在飲食療法基礎(chǔ)上配合運動治療、藥物治療等整體治療方案,有利于減少糖尿病發(fā)病率及死亡率[4-5]。然而目前能夠用于輔助治療糖尿病的特殊功能食品種類十分有限,難以滿足急劇增長的糖尿病患者(2011年全世界糖尿病患者約3.66億,我國已有9000多萬)龐大的需求。因此開發(fā)新型、價廉、有效的能夠預(yù)防或治療糖尿病的功能性食品具有重要意義,其中含α-葡萄糖苷酶抑制劑的食品研究開發(fā)是一個重要的方向。

豆渣是大豆加工產(chǎn)品如豆奶或豆腐加工過程中的副產(chǎn)品,中國、阿根廷、巴西、美國、日本等國家每年豆渣的產(chǎn)量很大[6-9]。豆渣中含有多種功能性成分,如膳食纖維、大豆蛋白、多糖、異黃酮、皂甙等,具有豐富的營養(yǎng)價值[10]。但由于豆渣含水量較高、保質(zhì)期短,這使得豆渣的利用受到一定的限制,大部分豆渣作為動物飼料直接喂養(yǎng)動物或者焚燒掉或者作為廢棄物堆放,不做任何利用,這造成了豆渣資源的極大浪費[11]。以鮮豆渣為原料,通過固體發(fā)酵的方式釀造具有功能特性的發(fā)酵豆渣,如具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的功能性豆渣,不僅能提高豆渣的利用價值,而且能為糖尿病患者功能性食品的研究奠定基礎(chǔ)。

本研究從市售發(fā)酵豆制品中篩選得到產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的菌株,并以其為發(fā)酵初始菌株固態(tài)發(fā)酵鮮豆渣,通過單因素實驗和正交實驗研究考察影響發(fā)酵豆渣α-葡萄糖苷酶抑制活性的因素,并對發(fā)酵豆渣中α-葡萄糖苷酶抑制劑的穩(wěn)定性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆豉、腐乳、霉豆渣 均購買于全國各地不同地區(qū)的超市、農(nóng)貿(mào)市場;大豆(小粒6號,2009年7月收獲) 吉林省農(nóng)科院,挑選顆粒飽滿、無蟲害的大豆,所用大豆品種有:小粒6號,中黃13號,鄭90007,東農(nóng)44號,中豆8號,中黃20號,豫豆25號,妥農(nóng)14號,使用自來水清洗干凈,使用純凈水按1∶3的比例室溫浸泡8h,待大豆內(nèi)部沒有干心后,再加入5倍于原來質(zhì)量的純凈水,磨漿后取渣,現(xiàn)做現(xiàn)用(水份含量85%,粗蛋白含量3.65%,粗脂肪含量1.37%,粗纖維含量9.22%,其它物質(zhì)含量0.76%);α-葡萄糖苷酶(Rat intestinal acetone powders)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside,4-NPG) Sigma;其它化學(xué)試劑 均為分析純;LB培養(yǎng)基 胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L,瓊脂15g/L,蒸餾水配制,調(diào)pH7.2,121℃蒸汽滅菌20min;液體種子培養(yǎng)基 胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L,蒸餾水配制,調(diào)pH7.2,121℃蒸汽滅菌20min。

Model 550酶標(biāo)儀 BIO-RAD Lab;T25BS4型均質(zhì)機 IKALabortechnik。

1.2 實驗方法

1.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定 在96孔酶標(biāo)板上,經(jīng)過稀釋的樣品中加入50μL α-葡萄糖苷酶溶液(25mg/mL),50μL 4-PNPG(0.9133mg/mL)及120μL 0.5mol/L的磷酸緩沖液(pH 6.7)。混勻后在37℃的培養(yǎng)箱中反應(yīng)45min。加入50μL碳酸鈉溶液(0.67mol/L)終止反應(yīng),在405nm下用酶標(biāo)儀測定吸光度值。樣品以相同體積的緩沖液代替所得的吸光度值作為對照。

α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=(A對-A樣)/A對×100

式中,A對:未加樣品孔的吸光度值,A樣:加樣品孔的吸光度值。

測定冷凍干燥的發(fā)酵豆渣樣品α-葡萄糖苷酶抑制活性需要對樣品進行預(yù)處理。稱取1.0g(m0)凍干粉置于20mL蒸餾水中,冰水浴均質(zhì)(15000r/min,2min)。

1.2.2 菌株的篩選

1.2.2.1 菌種的初篩 以從全國收集的45份發(fā)酵豆制品樣品為菌株來源,在無菌操作臺中,取材料(豆豉、腐乳)1g于滅菌試管中,加晾涼后的無菌水10mL,用棉塞封口,震蕩2min,稍靜置后吸取上清液1mL,稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6次,分別取0.2mL涂布LB平板。37℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果,挑選在LB培養(yǎng)基上的單菌落,經(jīng)劃線分純后分別編號。

1.2.2.2 菌種的復(fù)篩 分別從初篩菌株平板上取一環(huán)菌,接入新鮮液體種子培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)24h后,測定培養(yǎng)液的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

通過菌株初篩復(fù)篩得到9株細菌,分別編號為菌株1、2、3、4、5、6、7、8、9。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.3.1 接種量對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 稱取含水量約80%的鮮豆渣(小粒6號),盛放于蒸籠中,在高壓鍋121℃滅菌20min。豆渣于無菌操作臺晾涼后,自然pH條件下分別按0%、1%、2%、3%、4%(w:w)的比例接種,于恒溫恒濕培養(yǎng)箱(37℃,RH 90%)中培養(yǎng)。發(fā)酵48h后取樣冷凍干燥備用。

1.2.3.2 pH對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 稱取含水量約80%的鮮豆渣(小粒6號),盛放于蒸籠中,在高壓鍋121℃滅菌20min。豆渣于無菌操作臺晾涼后,調(diào)節(jié)pH分別為6.65、6.9、8.15、9.5,分別按2%(w:w)的比例接種,于恒溫恒濕培養(yǎng)箱(37℃,RH 90%)中培養(yǎng)。48h后取樣并凍干,然后測定其α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.2.3.3 含水量對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 鮮豆渣(小粒6號)在50℃下烘干,加入適量的蒸餾水,使得最終豆渣含水量分別為50%,60%,70%,80%,90%,在高壓鍋121℃滅菌20min。分別按2%(w:w)的比例接種,于恒溫恒濕培養(yǎng)箱(37℃,RH 90%)中培養(yǎng)。48h后取樣冷凍干燥備用。

1.2.3.4 豆渣原料品種對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 分別挑選8種不同品種的大豆,清洗干凈、浸泡、磨漿后取渣,分別盛放于蒸籠中,在高壓鍋121℃滅菌20min 。豆渣于無菌操作臺晾涼后,2%(w:w)的比例接種,于恒溫恒濕培養(yǎng)箱(37℃,RH 90%)中培養(yǎng)。發(fā)酵48h后冷凍干燥備用。

1.2.3.5 發(fā)酵溫度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 稱取含水量約80%的鮮豆渣(小粒6號),盛放于蒸籠中,在高壓鍋121℃滅菌20min。豆渣于無菌操作臺晾涼后,2%(w:w)的比例接種,采用不同溫度20、25、30、35、40、45、50℃對菌株固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng),培養(yǎng)48h后樣品冷凍干燥備用。

1.2.3.6 發(fā)酵時間對發(fā)酵豆渣α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 取鮮豆渣(小粒6號)200g(含水量80%),盛放于蒸籠中,在高壓鍋121℃滅菌20min 。豆渣于無菌操作臺晾涼后,按2%(w:w)的比例接種,于恒溫恒濕培養(yǎng)箱(37℃,RH 90%)中培養(yǎng)。分別在0、8、16、24、32、40、48、56、80h時取樣。凍干干燥備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌株的篩選

論文作者前期研究過程中曾從食品中篩選到一株枯草芽孢桿菌B2,并對其產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的抑制劑的能力展開了深入研究,并取得了一些正面的結(jié)果[12-13]。本研究在此基礎(chǔ)上,進一步篩選能產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的抑制劑的微生物菌株,以期獲得新的產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的抑制劑的菌株。從具有較強α-葡萄糖苷酶抑制活性的豆豉、豆醬及霉豆渣中初篩分離出45株細菌,經(jīng)搖瓶發(fā)酵得到9株抑制活性在10%以上的菌株,結(jié)果如圖1所示。其中,菌株4和菌株5的抑制活性最強,達到50%,從形態(tài)上初步判定菌株4和菌株5為同一株菌,通過菌落形態(tài)及顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)該菌株與枯草芽孢桿菌B2有明顯不同,選擇菌株5作為進一步研究對象。

圖1 不同菌種發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶的抑制活性 Fig.1 Inhibitory activity of fermented culture using different strains

2.2 固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 接種量對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 接種量對菌株5發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響如圖2所示。當(dāng)接種量大于2%時,發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性穩(wěn)定在50%以上,再增加接種量對抑制活性影響差別不大,當(dāng)接種量為1%以下時,發(fā)酵液的抑制活性不高,在后續(xù)實驗中將選擇接種量2%。

圖2 接種量對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 Fig.2 Effect of inoculation on the α-glucosidase inhibitory activity

2.2.2 初始pH對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 由圖3可見,培養(yǎng)基初始pH5時,菌株5發(fā)酵液的抑制活性僅為35%,抑制活性相對較低。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH6時,發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶活性達到45.7%。當(dāng)初始pH7時,抑制活性最高達到56%。隨著培養(yǎng)基初始pH進一步增加,發(fā)酵液抑制活性又逐漸下降,到pH10時,抑制活性為37.2%。培養(yǎng)基初始pH調(diào)節(jié)中性范圍的時候,α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高,偏酸性或偏堿性對α-葡萄糖苷酶的抑制活性有一定的影響,但影響程度較小。本文作者在研究液體發(fā)酵初始pH對枯草芽孢桿菌B2發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶的抑制活性影響時發(fā)現(xiàn),在酸性范圍內(nèi)時,pH的變化對抑制活性的影響顯著,在pH5時,發(fā)酵液幾乎沒有α-葡萄糖苷酶的抑制活性[14],相比而言,固態(tài)發(fā)酵初始pH對α-葡萄糖苷酶的抑制活性影響不如液態(tài)發(fā)酵顯著。

圖3 pH對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 Fig.3 Effect of pH value on the α-glucosidase inhibitory activity

2.2.3 含水量對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 在固態(tài)發(fā)酵中,水分含量是影響菌株生長及代謝的關(guān)鍵因素之一。當(dāng)豆渣含水量為80%時,α-葡萄糖苷酶抑制活性最高,達60.65%。水分對微生物生長及其產(chǎn)物的影響主要是由于水分對底物物理性質(zhì)的作用。高于最佳水分含量將使豆渣的多孔性降低,微粒結(jié)構(gòu)改變,氧氣輸送量減少;而低于最佳水分含量將導(dǎo)致固態(tài)底物中營養(yǎng)物質(zhì)的可溶性下降,而微生物也得不到足夠的水分進行生長[15]。

圖4 含水量對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 Fig.4 ffect of water content on the α-glucosidase inhibitory activity

2.2.4 豆渣品種對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 考察8種不同品種的大豆所制備的豆渣對菌株5發(fā)酵豆渣α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響。從圖5可以看出,菌株5以不同品種的大豆豆渣進行固態(tài)發(fā)酵,均能生長良好,所得發(fā)酵豆渣的α-葡萄糖苷酶抑制活性均在50%以上,并無顯著差異。

圖5 豆渣品種對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 Fig.5 ffect of okara variety on the α-glucosidase inhibitory activity

2.2.5 發(fā)酵溫度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 由圖6可見,40℃下發(fā)酵所得發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶抑制活性最強,達到59.3%。在35～45℃范圍內(nèi)發(fā)酵液的抑制活性均較高,在40%以上。但當(dāng)溫度低于35℃及高于45℃時,發(fā)酵液的抑制活性降低很快,20℃及50℃時的抑制活性分別是最高抑制活性的31.6%和21.8%。在溫度較低的情況下,菌體生長緩慢,因此當(dāng)發(fā)酵進行48h后,發(fā)酵液的抑制活性仍然不高。當(dāng)溫度增到50℃時,發(fā)酵液的抑制活性就顯著降低,這可能是因為高溫環(huán)境也會改變正常菌株合成α-葡萄糖苷酶抑制因子的能力[16]。

圖6 發(fā)酵溫度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 Fig.6 Effect of temperature on the α-glucosidase inhibitory activity

2.2.6 發(fā)酵時間對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 由圖7可見,當(dāng)發(fā)酵進行到12h時,發(fā)酵液具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性,隨著發(fā)酵時間的延長,抑制活性也增加,發(fā)酵進行到48h時,抑制活性達到49.3%,進一步延長發(fā)酵時間,抑制活性增長速度緩慢。發(fā)酵進行到96h時,抑制活性達56.4%。

圖7 發(fā)酵時間對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響 Fig.7 Effect of fermentation time on the α-glucosidase inhibitory activity

3 結(jié)論

本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的菌株,并對細菌5固態(tài)發(fā)酵豆渣的發(fā)酵條件進行優(yōu)化,結(jié)果表明:含水量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度對發(fā)酵豆渣的α-葡萄糖苷酶抑制活性影響較大。在豆渣含水量80%,接種量2%,初始pH6～8,發(fā)酵溫度40℃的條件下發(fā)酵48h,發(fā)酵豆渣表現(xiàn)出較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。在本研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,有望通過進一步研究得到含穩(wěn)定有效降血糖成分的功能性食品。同時,將發(fā)酵豆渣開發(fā)成特殊用途的食品,可以大大提高豆渣的利用價值,為豆渣的開發(fā)利用開辟新途徑。

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