脫羧酶基因ARO10的過量表達及其 對Saccharomyces cerevisiae的β-苯乙醇合成代謝影響

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(1.北京工商大學北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048;2.北京市食品風味化學重點實驗室,北京 100048;3.河南中大生物工程有限公司,鄭州 451162)

β-苯乙醇,又稱為2-苯乙醇,是一種具有持久淡雅玫瑰香氣的芳香醇類物質,廣泛應用于食品、化妝品和煙草行業[1-2]。天然β-苯乙醇主要存在于顯花植物的花果及其提取的精油中,但因其濃度低,提取困難,目前β-苯乙醇主要還是通過化學方法進行合成。雖然化學合成的成本低、產量高,但存在著環境污染嚴重,產生有毒副產物等弊端,不符合現代消費者崇尚“天然、安全和環保”的綠色消費理念[3-4]。由微生物轉化制備的香料,被稱為天然等同香料,符合“綠色生產”的安全標準,而且其構型、手性單一,有助于香氣品質的提高,是近年來天然香料制備的重要發展方向[5-6]。

國外已有部分學者通過研究釀酒酵母中氨基酸代謝來探索β-苯乙醇的微生物制備方法[7-8],而國內還鮮有報道。在釀酒酵母中,以L-苯丙氨酸為底物,經艾利希途徑合成β-苯乙醇,是β-苯乙醇生物轉化的快捷途徑,受到轉氨酶、脫羧酶和醇脫氫酶的調節[6,9]。Vuralhan等以苯丙氨酸、蛋氨酸和亮氨酸為唯一氮源進行恒化器培養,對培養得到的酵母細胞提取物進行分析,發現存在一種具有廣泛底物活性的脫羧酶Aro10p(EC 4.1.1.72)參與催化反應。ARO10是編碼這種脫羧酶的基因,其轉錄情況與α-酮酸脫羧酶在恒化器中培養時的表達情況密切相關;將除ARO10基因外的其他α-酮酸脫羧酶基因全部敲除,研究發現此突變株仍然表現出了脫羧酶活性[10-12]。因此認為增強ARO10基因拷貝與表達,有利于增強目的產物β-苯乙醇的產量。本文以S.cerevisiaeS288C為出發菌株,將脫羧酶基因ARO10進行過量表達,研究其對β-苯乙醇合成途徑的影響,為β-苯乙醇工程菌構建與改造提供指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

EscherichiacoliTOP10感受態細胞 購自北京天根公司;SaccharomycescerevisiaeS288C(ATCC 26108TM)、質粒PYES2-G418(G418抗性) 由本實驗室制備保藏;質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒 購于OMEGA公司;酵母質粒提取試劑盒 購于北京天根生化科技有限公司;pMD19-T Simple Vector、DNA marker、Ex Taq、限制性內切酶、T4 DNA 連接酶 購于TaKaRa公司;酵母提取物、胰蛋白胨 購于北京拜爾迪生物公司;甲醇(色譜純) 購于Fisher公司;β-苯乙醇 為本院香精香料實驗室制備;其余試劑均為國產分析純。

1.2 培養基

LB培養基[13]、YPD種子培養基[13]。

發酵培養基(g/L):無氨基酸氮源YNB 1.8,蔗糖40,L-苯丙氨酸7,Na2HPO40.5。

1.3 方法

1.3.1ARO10基因的克隆與表達載體構建 根據Genbank和相關文獻[14]中公布的S.cerevisiae3-磷酸甘油激酶基因啟動子片段Ppgk和S.cerevisiaeAR010基因編碼序列,利用Primer 5.0軟件設計引物。擴增Ppgk所用引物:PGK-F:5′-TATCAGACCGGTTATTTTAGATTCCTGACTT-3′,下劃線部分為酶切位點AgeI,PGK-R:5′-CGCTCGCAGCTGTGTTTTTATATTTGTTGT-3′,下劃線部分為酶切位點PvuII。擴增ARO10的引物ARO10F:5′-CGAGCTCATGGCACCTGTTACAATT-3′,下劃線部分為酶切位點SacI;ARO10R:5′-CTCTAGACTATTTTTTATTTCTTTTAAGTGCC-3′,下劃線部分為酶切位點XbaI。酵母轉化子檢測所用引物:

T7F:5′-CAGCTGTAATACGACTCACTATAGGG-3′,

CYC1R:5′-AAATAAATAGGGACCTAGACTTC AGG-3′。

以S.cerevisiaeS288C 基因組為模板,Ex Taq DNA Polymerase進行PCR反應。25μL反應體系如下:Ex Taq聚合酶0.3μL,基因組<1μg,上下游引物各1μL(10μmol/L),dNTP混合物4μL(2.5mmol/L),10×Ex Taq Buffer 5μL,ddH2O 至25μL;

擴增Ppgk和ARO10基因的反應條件分別為:94℃ 5min;94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 40s,30 個循環;72℃ 10min。

94℃ 5min;94℃ 30s,58℃ 30s,72℃ 2min,30個循環；72℃ 10min。

分別將擴增的Ppgk片段和ARO10片段連接到pMD19-T Simple質粒,進行測序;對可能帶有Ppgk片段和ARO10基因的質粒pMD19-T-Ppgk、pMD19-T-ARO10進行酶切回收。

重組質粒pYES2-Ppgk-ARO10構建見圖1。先用AgeI和PvuII分別對質粒pMD19-T-Ppgk和pYES2-G418于37℃酶切5h。將酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離,用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段,經 T4 DNA Ligase于4℃連接過夜,連接產物轉化于E.coliTOP10感受態細胞,選取陽性菌落擴繁并進行重組質粒提取,得到質粒pYES2-Ppgk。再用SacI和XbaI分別對質粒pMD19-T-ARO10和pYES2-Ppgk進行酶切,其余方法同上,最終得到重組質粒pYES2-Ppgk-ARO10。

圖1 重組質粒pYES2-Ppgk-ARO10的構建策略 Fig.1 The construction strategy of recombinant plasmid of pYES2-Ppgk-ARO10

1.3.2 重組質粒在釀酒酵母中的表達 利用PEG/LiAc高效酵母轉化方法將空載pYES2-Ppgk和重組表達載體pYES2-Ppgk-ARO10分別導入S.cerevisiaeS288C感受態細胞中,獲得的酵母轉化子經PCR驗證。將酵母陽性克隆接種到YPD液體培養基中,于30℃,200r/min,過夜振蕩培養。取適量菌液接種于發酵培養基中,最終調至OD600=0.25,30℃繼續培養,每隔一定時間收集發酵液。高效液相色譜(HPLC)檢測發酵液中的β-苯乙醇。

1.3.3 β-苯乙醇的HPLC檢測與數據處理 準確吸取0.100g β-苯乙醇并加水定容于10mL容量瓶中,制成10g/L的貯備液,再分別吸取貯備液10、30、50、70、80、100和150μL加水混勻定容于7個10mL容量瓶中制成0.01、0.03、0.05、0.07、0.08、0.10和0.15g/L的標準溶液,經0.45μm微孔濾膜過濾裝入色譜分析瓶,HPLC檢測其峰面積,以標準溶液濃度為橫軸,測得的峰面積為縱軸繪制其標準曲線。

將獲得的釀酒酵母轉化子SP10發酵培養,收集得到的發酵液8000r/min離心,取適量上清液稀釋10倍用于β-苯乙醇的HPLC檢測。檢測β-苯乙醇采用LC-20A島津液相色譜儀,檢測條件[15]為:色譜柱 RP-C18 色譜柱(4.6mm×150mm,5μm),V(甲醇)∶V(水)=50∶50作為流動相,檢測波長215nm,進樣量10μL,流速1.0mL/min。由此測出發酵液中β-苯乙醇特征峰的峰面積,代入上述標準曲線,即可得出發酵液中的β-苯乙醇濃度,再利用Excel 2003對其濃度和發酵時間作圖。

2 結果與分析

2.1 ARO10基因的克隆與表達載體構建

以S.cerevisiaeS288C基因組為模板,分別用上下游引物PGK-F,PGK-R;ARO10F,ARO10R,擴增目的片段Ppgk和ARO10,PCR產物電泳檢測。由圖2和圖3可知,擴增得到的單一DNA片段分別為780bp和1900bp左右,與預期大小相符。

圖2 基因Ppgk的擴增 Fig.2 Amplification of Ppgk gene by PCR

圖3 基因ARO10的擴增 Fig.3 Amplification of ARO10 gene by PCR

DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段,連接到pMD19-T Simple Vector,連接產物轉化大腸桿菌E.coliTOP10感受態細胞,選取陽性菌落擴繁并進行酶切驗證,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。篩選得到的轉化子均切下大小正確的條帶,且測序結果與Genbank 所公布基因序列一致。

按照1.3.1的方法構建重組質粒pYES2-Ppgk和pYES2-Ppgk-ARO10,將經測序正確的陽性轉化子過夜培養,用質粒小提試劑盒提取質粒pYES2-Ppgk和pYES2-Ppgk-ARO10。分別對兩種質粒進行酶切驗證,酶切鑒定見圖4及圖5。

圖4 質粒pYES2-Ppgk的酶切驗證 Fig.4 Restriction analysis of plasmid pYES2-Ppgk

圖5 質粒pYES2-Ppgk-ARO10的酶切驗證 Fig.5 Restriction analysis of plasmid pYES2-Ppgk-ARO10

2.2 重組釀酒酵母的篩選與鑒定

重組質粒pYES2-Ppgk和pYES2-Ppgk-ARO10轉入釀酒酵母后,在含G418的YPD平板上進行篩選,在G418濃度達到200μg/mL的平板上未見釀酒酵母S288C菌株生長。

分別從轉入質粒pYES2-Ppgk和pYES2-Ppgk-ARO10的篩選平板上挑取幾個單菌落作為重組菌株,提取轉化子的質粒,為避免假陽性結果的出現,分別選擇引物PGK-F/CYC1R和引物T7F/CYC1R對兩種質粒進行PCR擴增,擴增的片段大小約為1000bp和2000bp。凝膠電泳檢測結果如圖6、圖7顯示,篩選到的轉化子中均擴增出目的基因特異性條帶,表明構建的兩種重組質粒均已轉化進入釀酒酵母菌株中;陰性對照為已轉化質粒pYES2-G418的釀酒酵母S288C菌株,無目的條帶。

圖6 pYES2-Ppgk轉化子PCR驗證 Fig.6 The detection of pYES2-Ppgk transformants by PCR

圖7 pYES2-Ppgk-ARO10轉化子PCR驗證 Fig.7 The detection of pYES2-Ppgk-ARO10 transformants by PCR

2.3 搖瓶發酵實驗和β-苯乙醇檢測

β-苯乙醇的標準溶液經高效液相色譜(HPLC)分析,β-苯乙醇特征峰的出峰時間約在9min. 按照1.3.3中β-苯乙醇標準曲線繪制的方法,處理和進樣測定,以β-苯乙醇質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪出標準曲線(圖8)。β-苯乙醇在0.01～0.15g/L 范圍內呈現良好線性關系,線性回歸方程為y=2×107x-10005(R2=0.9976)。

圖8 β-苯乙醇標準曲線 Fig.8 Standard Curve of β-phenethyl alcoho

按照1.3.3中的檢測條件,對發酵液進行液相色譜分析,能夠較好的分離β-苯乙醇,并通過其峰面積與標準曲線,計算其在發酵液中的濃度。由圖9可知,β-苯乙醇生成量隨著發酵時間的延長逐漸積累,發酵60h時其生成量達到最高,導入空質粒pYES2-Ppgk的重組菌株SP和S.cerevisiaeS288C野生菌,β-苯乙醇的生成量均為0.86g/L,轉化子SP10的β-苯乙醇的生成量為1.0g/L,相較前兩者均提高16.3%;繼續發酵到96h,由于β-苯乙醇的積累對于酵母細胞有一定的毒性作用,抑制其生長,且在搖瓶過程中有一些揮發損失,所以β-苯乙醇產量沒有再增加,而是均有小幅度的下調。結果表明,S.cerevisiaeS288C中脫羧酶是β-苯乙醇生物合成途徑的關鍵酶,增強脫羧酶基因ARO10的克隆及基因表達,有利于提高β-苯乙醇的產量,為將來β-苯乙醇的釀酒酵母工程菌構建提供了方向。

圖9 發酵時間對S. cerevisiae的β-苯乙醇合成的影響 Fig.9 The β-phenethyl alcohol content in different time

3 結論與討論

3.1 結論

將PGK1啟動子片段克隆并替換原pYES2-G418穿梭質粒中的誘導型啟動子,構建新的表達載體pYES2-Ppgk;再將脫羧酶基因ARO10克隆與表達載體pYES2-Ppgk連接,構建了釀酒酵母表達質粒pYES2-Ppgk-ARO10。經測序驗證后,LiAc/SSDNA/PEG方法轉化至S.cerevisiaeS288C中進行表達,通過基因表達、發酵產物測定等不同水平檢測,結果表明,構建的釀酒酵母轉化子SP10 β-苯乙醇產量有所提高,發酵60h時,其生成量達到1.0g/L,較野生型菌株提高了16.3%。因此,PGK1啟動子可用于穿梭質粒的啟動表達,且新構建的表達載體可以使脫羧酶基因ARO10在釀酒酵母中過量表達;S.cerevisiaeS288C中脫羧酶Aro10p是β-苯乙醇生物合成途徑的關鍵酶,增強脫羧酶基因ARO10的克隆及基因表達,有利于增強β-苯乙醇的合成代謝及目的產物產量的提高

3.2 討論

啟動子是表達載體上不可或缺的核心元件之一,其活性強弱直接影響目的基因轉錄效率的高低,進而影響基因表達水平。本研究使用的釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶PGK1基因的啟動子為組成型強啟動子,轉錄活性高,已廣泛應用于外源基因在釀酒酵母中的表達;此外,采用組成型表達的策略無需加入誘導劑,避免了對誘導物濃度、誘導時間和溫度等條件進行優化的繁瑣工作,使目的基因的表達更高效方便,同時消除了誘導物對目的產物代謝途徑的影響并有利于后續實驗開展重組菌株的代謝流量分析。

脫羧酶基因ARO10在釀酒酵母中的過量表達有利于增強β-苯乙醇的合成代謝及目的產物產量的提高。但其產量并沒有達到最理想水平,可能有幾方面的原因:一是實驗所用培養基與培養條件沒有進行優化;二是只進行了小規模的搖瓶發酵,還未進行發酵罐的發酵實驗,由于在發酵過程中,無法進行補料和一些重要發酵參數的控制,所以在一定程度上限制了β-苯乙醇的產量;三是β-苯乙醇的合成代謝通路中有多種酶進行調控,改變其中一些基因的表達,對于目的產物的代謝流量的影響有限,本實驗室也正在構建氨基轉移酶ARO8基因與脫羧酶ARO10基因耦合過量表達以及副反應途徑基因敲除的工程菌,以增強主反應途徑的相關酶基因的表達及代謝流量,減弱或阻斷副產物支路代謝流量,為后續的研究提供了思路和技術數據的支持。

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