金黃色葡萄球菌活的非可培養狀態的 誘導和復蘇

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(華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642)

1982年,徐懷恕等通過對霍亂弧菌和大腸桿菌存活規律的觀察,首次提出細菌“活的非可培養狀態(viable but non-culturable state,VBNC)”的存在[1]。微生物的VBNC狀態近年來受到了學者們的廣泛關注。至2010年,70多種細菌被發現能進入這種狀態[2]。VBNC狀態是細菌的一種特殊存活形式,是指細菌處于不良環境條件下,細胞縮小成球形,用常規方法培養不能生長繁殖,但仍然具有代謝活性的一種特殊生理狀態[3]。進入VBNC狀態的細菌存在潛在的致病性,不但具有與正常細胞類似的抗原成分、毒力因子,還保留了較低的代謝活性[4],且經過適宜條件下復蘇后,可以重新獲得感染能力,對人類以及周圍環境造成嚴重威脅[5]。

不同細菌甚至同一細菌的不同菌株進入VBNC狀態的條件以及復蘇條件都不盡相同。溫度、射線、鹽度或滲透壓、寡營養、干燥、pH的劇烈變化等可能引起細菌一系列的生理變化,進入VBNC狀態。而大多數報道中,VBNC菌的復蘇方法主要有:逐步升溫法、與宿主共同培養法、化學物質添加法、富營養培養法等。

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)是一種常見的病原菌,可引起嚴重感染。其廣泛分布于自然界,因此食品受污染的機會很多,常見于奶、肉、蛋、魚及其制品,另外,剩飯、油煎蛋、涼粉引起的中毒事件也有報道。美國疾病預防控制中心報告,由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位,僅次于大腸桿菌。

食源性致病菌是造成食品安全問題的首要因素。然而,目前細菌檢測基本是利用傳統的培養方法,此方法因無法檢測出VBNC菌而易造成漏檢現象。因此,VBNC狀態的發現不僅讓人們對微生物應對不良環境的生理變化有了新的認識,同時也為流行病學、食品安全、水質監測、食品衛生檢驗等許多方面的研究做出了重大貢獻[6]。本文采用低溫和食品防腐劑山梨酸鉀等條件誘導金黃色葡萄球菌進入VBNC狀態,對其復蘇條件進行研究,為金黃色葡萄球菌VBNC狀態的研究提供了理論依據,對加強食品安全的檢測和控制亦具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瓊脂粉、蛋白胨 北京奧博生物技術有限責任有限公司;牛肉膏、酵母浸出汁、NaCl 國藥集團化學試劑有限公司;吐溫20、吐溫80、山梨酸鉀 東盛生物有限公司;腦心浸液培養基(BHI) 廣州環凱微生物科技有限公司;API STAPH生化鑒定試劑盒 法國生物梅里埃公司;金黃色葡萄球菌標準菌株 編號26003,中國醫學細菌保藏管理中心,在4℃條件下保存于7.5% NaCl的牛肉膏蛋白胨斜面上,并接種于斜面中于37℃培養活化。

150A恒溫培養箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;Forma Class A2生物安全柜 Thermo公司;掃描電鏡 德國TVIPS公司;5417R高速冷凍離心機 德國Eppendorf股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌的誘導 根據實驗菌株的適宜培養條件,選擇對細菌生長不利條件作為誘導VBNC狀態的候選因素。在考慮溫度、pH、養分、鹽度、山梨酸鉀濃度的基礎上,確定誘導條件。在單因素實驗的基礎上,進一步采用混合均勻設計誘導方案,選定對金黃色葡萄球菌進入 VBNC狀態具有重要影響的3個因素,其中溫度和山梨酸鉀的濃度各取3個水平,營養條件為2個水平,富營養(含7.5% NaCl的肉湯)記為1,寡營養(含7.5% NaCl溶液)記為0,實驗因素及水平見表 1。

誘導過程中每隔2d取樣,用平板計數記錄菌數的變化,當可培養細菌數降到0時,再連續測定3d可培養細菌數仍然為0時,即初步認為實驗細菌進入VBNC狀態。以誘導天數為評價指標,對誘導方案進行評價。

表1 實驗因素水平U6(32×21)Table 1 Experiment factors U6(32×21)

1.2.2 VBNC狀態金黃色葡萄球菌的復蘇 分別采用直接升溫法(升溫至37℃)、添加液體培養基升溫法(含0.5%、7.5% NaCl的肉湯,BHI液體培養基)、添加不同濃度酵母液(0.025%、0.05%、0.1%)的培養基升溫法、添加不同濃度吐溫20或吐溫80(0.25%、0.5%、1%)的培養基升溫法對VBNC狀態的金黃色葡萄球菌進行復蘇。每隔24h取合適稀釋度的菌液100μL涂布營養瓊脂平板,于37℃培養,觀察是否有菌落長出。繪制VBNC狀態金黃色葡萄球菌復蘇生長曲線。

1.2.3 金黃色葡萄球菌的形態觀察 將正常狀態以及復蘇后的金黃色葡萄球菌劃線于平板上,進行菌落形態觀察,并對菌體進行革蘭氏染色觀察和掃描電鏡觀察,描述細菌個體形態特征。

1.2.4 復蘇后金黃色葡萄球菌的生理生化特性 對復蘇的金黃色葡萄球菌進行生理生化特性分析,采用法國生物梅里埃公司的API STAPH試劑條進行。根據說明書判斷反應,參照分析圖索引和鑒定軟件可以得出鑒定的結果。

1.2.5 數據處理方法 利用DPS7.05軟件數據處理系統對實驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌VBNC狀態的誘導

2.1.1 不同pH和低溫條件下金黃色葡萄球菌的存活 由圖1可以看到,低溫環境中,6種pH條件下的金黃色葡萄球菌隨著處理時間的增加,其數量都呈下降趨勢。其中pH3.8和pH4.4的曲線下降最快,經過近3個月的處理后,細菌的存活數量已經接近于0,這意味著有可能進入VBNC狀態。而其他pH下,菌數下降到一定程度后,仍有一定的活菌。

圖1 金黃色葡萄球菌在不同pH條件下4℃中的存活曲線 Fig.1 Survival curves of S. aureus under 4℃ at different pH

2.1.2 金黃色葡萄球菌在山梨酸鉀溶液中的存活 圖2顯示金黃色葡萄球菌在山梨酸鉀溶液中經過一定時間的誘導,可培養菌的總數不斷減少。從第16d開始,4℃下的金黃色葡萄球菌存活菌數由原來最初的2.10×109CFU/mL下降至0,經過再次平板涂布實驗后,確定已無存活菌,說明其可能進入VBNC狀態。而37℃條件下至16d的金黃色葡萄球菌存活菌數仍維持在2.60×104CFU/mL,未能進入VBNC狀態。

圖2 金黃色葡萄球菌在山梨酸鉀溶液中的存活曲線 Fig.2 Survival curves of S. aureus in potassium sorbate solutions

2.1.3 不同鹽度下金黃色葡萄球菌的存活 從圖3可知,在誘導的過程中,金黃色葡萄球菌具有一定的耐鹽性,在誘導初始,均受到一定的抑制,但在耐鹽范圍內的金黃色葡萄球菌隨后開始適應環境,而高鹽度(20%)下金黃色葡萄球菌受到了明顯抑制,但都未能進入VBNC狀態。

圖3 金黃色葡萄球菌在不同鹽度下的存活曲線 Fig.3 Survival curves of S. aureus under different salinity

2.1.4 混合均勻設計誘導方案下金黃色葡萄球菌的存活 隨著誘導時間的延長,金黃色葡萄球菌可培養數不斷減少,下降最慢的是10mmol/L山梨酸鉀富營養狀態37℃的誘導方案(誘導方案1),當至132d時,可培養菌總數下降為0;而0.5mmol/L山梨酸鉀、寡營養狀態、-20℃條件下(誘導方案6),誘導時間最短,為76d;另外4種誘導方案下分別于84、84、85、85d進入VBNC狀態,結果如圖4。不同誘導條件下的誘導天數見表2。

圖4 不同誘導條件下金黃色葡萄球菌的存活曲線 Fig.4 Survival curves of S. aureus under different induce conditions

利用DPS7.05軟件數據處理系統對表2所示實驗結果進行二次多項式逐步回歸分析,得回歸方程:

Y=80.7645460+0.14842831047X2+2.9719679350X1×X3+0.4339634295X2×X3

表2 不同誘導條件下的誘導天數Table 2 The induce period of different induce conditions

2.2 VBNC狀態金黃色葡萄球菌的復蘇

2.2.1 直接升溫復蘇法 經每隔24h取樣37℃培養觀察,發現直至14d后仍未發現有菌落生長。因此,推測單純采用升溫復蘇的方法不能使VBNC狀態的金黃色葡萄球菌復蘇。

2.2.2 添加液體培養基升溫復蘇法 經每隔24h取樣37℃培養計數,發現采用肉湯培養基升溫的方法不能使菌體復蘇,直至14d后仍未見有菌落長出。而采用BHI液體培養基升溫復蘇法培養2d時,取樣涂布營養瓊脂平板可見有大小一致的金黃色葡萄球菌單一菌落,菌數為102CFU/mL。隨著復蘇時間的延長,可培養細菌數迅速增加,至 5d時,可培養菌數約為107CFU/mL。表明BHI液體培養基復蘇法可使VBNC狀態的金黃色葡萄球菌復蘇。

2.2.3 添加酵母液升溫復蘇法 經每隔24h取樣37℃培養觀察,發現14d后仍未有菌落生長。因此推測添加酵母液升溫的方法不能使VBNC狀態的金黃色葡萄球菌復蘇。

2.2.4 添加吐溫升溫復蘇法 經每隔24h取樣37℃培養觀察,發現采用0.25%的吐溫20或吐溫80培養液升溫的方法不能使菌體復蘇,而采用0.5%及1%的吐溫20或吐溫80培養液升溫復蘇法培養2d時,可培養菌落數達到1.0×102CFU/mL,隨著復蘇時間的延長,可培養細菌數迅速增加,至5d時,可培養菌數最多達到1.0×108CFU/mL。吐溫20和吐溫80的濃度越大,菌落數越多,且相同濃度下吐溫80復蘇的菌落數略多于吐溫20。結果如圖5所示。

表3 復蘇后及正常狀態的金黃色葡萄球菌的生理生化檢測結果Table 3 The identification results of the resuscitative and normal cells by API STAPH system

圖5 VBNC狀態金黃色葡萄球菌在吐溫20 及吐溫80培養液中的復蘇曲線 Fig.5 Resuscitation curves of S. aureus in Tween 20 and Tween-80 solutions

2.3 金黃色葡萄球菌的形態觀察

在普通營養瓊脂平板上,正常狀態的及復蘇后的金黃色葡萄球菌菌落厚、表面光滑濕潤、圓形凸起、邊緣整齊,但正常狀態的菌落呈黃色,復蘇后的菌落乳白色,而進入VBNC狀態的金黃色葡萄球菌無法長出菌落。

取正常狀態、VBNC狀態及復蘇后的金黃色葡萄球菌在掃描電鏡下進行觀察,發現正常狀態及復蘇后的金黃色葡萄球菌呈圓球狀(圖6a,圖6b),而進入VBNC狀態的細胞變成不規則球形,細胞體積變小,且菌體分散(圖6c)。

圖6 掃描電鏡下不同狀態的 金黃色葡萄球菌的形態特征(×10000) Fig.6 Morphological characteristics of different states of S. aureus

2.4 復蘇后的金黃色葡萄球菌的生理生化特性

以法國生物梅里埃公司的API STAPH生化鑒定試劑盒對復蘇的金黃色葡萄球菌進行生化鑒定,按照API STAPH生化反應表對反應的結果進行判讀和記錄,結果見表3。將鑒定結果輸入軟件,得出復蘇菌株的鑒定百分比為98.1%。復蘇后的菌株除尿素酶陰性外,其他代謝特征均與標準菌株相同,因此可推斷VBNC狀態的金黃色葡萄球菌經過復蘇基本恢復了正常的代謝過程。

3 結論與討論

3.1 金黃色葡萄球菌VBNC狀態的誘導

誘導細菌進入VBNC狀態的條件較多,其中,低溫、高溫、寡營養、重金屬、光照等是主要的影響因素[7]。本研究采用了不同pH、溫度、不同濃度山梨酸鉀以及不同鹽度處理等方法對金黃色葡萄球菌進行誘導,結果發現低溫對誘導影響最大,且溫度越低誘導天數越短,山梨酸鉀濃度與營養條件對金黃色葡萄球菌的誘導起協同作用。而單一的條件處理,如鹽度,在本實驗中未能成功誘導金黃色葡萄球菌進入VBNC狀態。說明金黃色葡萄球菌對不良環境的適應性較強,需更為不利的環境才有可能誘導其進入狀態。

3.2 VBNC狀態金黃色葡萄球菌的復蘇

本研究對菌株的復蘇采用了直接升溫復蘇法、添加液體培養基升溫復蘇法、添加酵母液升溫復蘇法及添加吐溫的升溫復蘇法。最后實現復蘇的是采用BHI培養基升溫的方法,以及添加0. 5%和1%的吐溫20或吐溫80的培養液升溫方法,由復蘇曲線顯示,5d后所有復蘇的金黃色葡萄球菌均達到了1.0×106的數量級以上,且相同濃度下吐溫80培養液的復蘇能力優于吐溫20。

復蘇看似簡單的誘導逆過程,即將誘導因素去除,復蘇就可以實現。然而事實上,復蘇是一個極其復雜的過程,同種復蘇方法對于不同細菌乃至同一細菌的不同菌株的影響都不盡相同。Jiang等[8]發現進入VBNC狀態的副溶血弧菌在溫度由3.5℃升高到室溫后,3d內就可從活的非可培養狀態恢復為可培養狀態。而魯梅芳等[9]研究指出,逐步升溫法對于VBNC狀態的金黃色葡萄球菌沒有任何作用。本實驗采用直接升溫復蘇法、添加肉湯培養基升溫復蘇法、添加酵母液升溫復蘇法均沒有使VBNC狀態的金黃色葡萄球菌復蘇成功,而采用BHI培養基升溫方法,以及添加0.5%、1%的吐溫20及吐溫80培養液升溫的方法,細菌恢復為可培養狀態。Bloomfield等[10]研究推測,由于營養缺乏而進入VBNC狀態的微生物,其營養機制與轉運途徑之間親和力有了極大的提高,當重新接種到營養豐富的培養基上時,由于過量營養物質的攝入,基質會迅速氧化導致過多的自由基和超氧化物的產生,從而損害了細胞甚至導致其死亡。因此,實驗中的營養物質,如肉湯和酵母液,可能會導致產生過多損害細胞的自由基和超氧化物,使其無法復蘇。而吐溫20及吐溫80為非離子表面活性劑,可降低表面張力,從而增大細菌的活性,且其可為VBNC狀態的金黃色葡萄球菌提供充分的碳源,使細菌恢復可培養狀態[11]。本研究中,相同濃度下吐溫80培養液的復蘇能力優于吐溫20,可能是由于吐溫80的乳化性較強,可作為增溶劑,從而增強了復蘇的效果。

[1]Xu HS,Robert N,Singleton FL,etal. Surival and viability of non-culturable Escherichia coli andVibriocholeraein the estuarine and marine environment[J]. Microbial Ecology,1982,8:313-323.

[2]Oliver JD. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria[J]. FEMS Microbiol Rev,2010,34:415-425.

[3]鄭天倫,王國良,王珊. 細菌的“活的非可培養狀態”[J].自然雜志,2010,24(4):209-212.

[4]王啟俊,祝偉星,刑秀梅.北京城區女性乳腺癌發病死亡和生存情況20年監測分析[J].中華腫瘤雜志,2006,28(3):208-210.

[5]劉端.細菌“活的非可培養狀態”研究進展[J].疾病監測,1998,13(9):13-20.

[6]楊政. 三種致病菌“活的非可培養狀態”的誘導與研究[R]. 天津:天津科技大學,2009.

[7]Oliver JD. The viable but nonculturable state in bacteria[J]. J Microbiol,2005,43:93-100.

[8]Jiang XP,Chai TJ. Survival ofVibrioparahaemolyticusat low temperatures under starvation conditions and subsequent resuscitation of viable but nonculturable cells[J]. Appl Environ Microbiol,1996,62(4):1300-1305.

[9]魯梅芳,金玉妍. 金黃色葡萄球菌活的非可培養狀態的誘導和檢出[J]. 環境與健康雜志,2009,26(10):877-879.

[10]Bloomfield SF,Stewart GS,Dedd CE,etal. The viable but nonculturable phenomenon explained[J].Microbiology,1998,144(1):l-3.

[11]魏忠彬,李影. VBNC狀態乳酸桿菌的復蘇[J]. 中國飼料,2006(18):27-28.