枯草芽孢桿菌K-6-9發酵條件優化及放大

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(上海海洋大學上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306)

微生態添加劑以其天然、綠色、無毒副作用、無殘留的優點近年內引起世界各國的關注,并逐步成為替代抗生素添加劑的主力[1]。甘露寡糖以低熱、安全、無毒,而且能改善動物體內微生物環境、提高動物免疫力等特有的功效引起人們極大的興趣。在健康養殖的趨勢下,甘露寡糖替代抗生素的使用已成為研究熱點,是最有研究前景的抗生素替代品之一[2-3]。甘露聚糖酶(mannanase)是一種半纖維素水解酶,是制備甘露寡糖的關鍵酶之一,其以內切方式降解甘露聚糖糖苷鍵,降解產物的非還原末端為甘露糖、甘露寡糖。甘露聚糖酶來源廣泛,而微生物是甘露聚糖酶的主要來源,其中利用分泌甘露聚糖酶微生物菌種制備直投式發酵劑,可以大大降低工廠制備甘露寡糖的過程,并具有降低環境污染等優勢。

現在市面上主要是以魔芋作為甘露聚糖的主要來源,而目前市場上為數不多的寡糖類產品寡糖純度只在35%～55%,而且因含單糖和淀粉類物質而難于保存[4]。我國是啤酒酵母生產大國,廢棄的啤酒酵母細胞壁中同樣含有豐富的甘露聚糖,甘露聚糖占酵母細胞壁干重的40%左右[5],甘露聚糖存在于酵母細胞壁外層[6],以共價鍵形式與蛋白質連在一起,因此又稱之為甘露聚糖蛋白[7]。因此利用啤酒酵母中甘露聚糖,制備高純度的甘露寡糖,已經成為近幾年的研究熱點。

本實驗室前期分離改良的枯草芽孢桿菌K-6-9在生長過程中能產生大量的異甘露聚糖酶酶活力高達601.6U/mL[21],能將啤酒酵母細胞壁中的甘露聚糖分解成甘露寡糖。本實驗以芽孢量為指標,將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)K-6-9首先進行搖瓶發酵,通過培養基及其發酵條件的優化研究,然后進行擴大培養,為該菌株后期制成直投式發酵劑提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)K-6-9由本實驗室分離保藏;種子培養基和基礎發酵培養基 葡萄糖5g/L、牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、pH7.0[8];菌種、芽孢計數和保藏培養基 葡萄糖5g/L、牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、瓊脂2g/L、pH7.0。

PL-202-L型電子天平 梅特勒-托多利儀器(上海)有限公司;WFZ UV-200型紫外可見分光光度計 尤尼科(上海)儀器有限公司;DHG-9053A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;SJH-4S型數控精密恒溫水浴鍋 寧波天恒儀器廠;pH S-3C酸度計 雷磁儀器廠;DKY-Ⅱ型 恒溫調速回轉式搖床 上海杜科自動化設備有限公司;FMG(I)型臺式發酵罐 上海國強生化工程裝備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 活菌數和芽孢數的測定 活菌數:將發酵液稀釋至10-3～10-7,然后取10μL涂布于固體培養基平板上,每個濃度3個重復,18h后計算活菌數。芽孢數:將發酵液置于80℃水浴10min按照活菌的測定方法進行測定[9-11]。

1.2.2 發酵液pH的測定 取發酵液直接用精密pH計測定。

1.2.3 菌種活化及種子液的配制 從冰箱中取出枯草芽孢桿菌斜面菌種,室溫靜置40min;用接種環從斜面取厚實二環菌種接種于三角瓶液體培養基上,37℃、160r/min搖床活化培養18h,此時活菌數約為108CFU/mL,芽孢量約為105CFU/mL作為種子菌液備用[12]。

1.2.4 培養時間的確定 50mL/250mL(以下同)的三角瓶液體培養基中接入2.0%枯草芽孢桿菌K-6-9原菌液,置于37℃,160r/min搖床活化培養24h,其間每隔3h取樣測定菌液活菌數和芽孢量確定最佳培養時間。

1.2.5 枯草芽孢桿菌K-6-9培養基成分的優化 最佳碳源篩選:分別以含量為1%(W/V)的蔗糖、乳糖、麥芽糖、乳糖、棉籽糖、果葡糖漿等6種碳源去替換初始發酵培養基中的葡萄糖,其他成分變,以葡萄糖為對照。按2%的接種量接種種子液,于160r/min、37℃條件下搖瓶培養18h,每個處理做個3重復,通過芽孢產量進行對比選擇(以下同)。

最佳氮源篩選:分別以含量為1%(W/V)的牛肉膏、酵母粉、胰蛋白胨、尿素、NH4NO3、NH4Cl、等6種氮源去替換初始發酵培養基中的魚粉蛋白胨,以魚粉蛋白胨對照。其它發酵條件同上,通過芽孢產量進行對比選擇。

最佳無機鹽篩選:根據先相關文獻[13-16],分別以含量為 0.3%(W/V)的MnSO4、MgSO4、KH2PO4、NaCl,CaCl2等5種無機鹽去替換初始發酵培養基0.5%(W/V)NaCl,以0.5%(W/V)NaCl和不添加為對照。其它發酵條件同上,通過芽孢產量進行對比選擇。

1.2.6 正交實驗優化培養基成分 對篩選得到的最佳碳源蔗糖(A)和最佳氮源胰蛋白胨(B)以及發酵培養基中促生長無機鹽CaCl2(C),MgSO4(D),KH2PO4(E),進行5因素4水平的正交實驗,考慮到碳源與氮源之間的互作,采用 L16(45)正交表確定各組分的最佳配比,共16個處理組合,每個處理做4個重復。正交實驗各因素及水平見表1。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment

1.2.7 草芽孢桿菌K-6-9培養條件的優化

1.2.7.1 最適接種量的測定 按照1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量將種子液分別接到50mL/250mL優化后的發酵液中(以下同),培養18h,通過芽孢產量進行對比選擇。

1.2.7.2 最適生長pH的測定 發酵培養基初始pH設置為5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、8.0,按照最佳接種量接入優化后發酵液中,在37℃培養18h,通過芽孢產量進行對比選擇。

1.2.7.3 最適生長溫度的測定 溫度設置為28、32、35、37、39、42℃,按照最佳接種量接入優化后發酵液中,在不同溫度下培養18h,通過芽孢產量進行對比選擇。

1.2.7.4 最適轉速的測定 將枯草芽孢桿菌以合適接種量接到優化后發酵培養基中,搖床轉速分別調節為 120,140、160、180、200、220r/min;按照最佳接種量接入優化后發酵液中,在最適生長溫度下培養18h,通過芽孢產量進行對比選擇。

1.2.8 擴大培養 采用5L發酵罐,接種量和發酵量均和搖瓶發酵條件相同,通氣量維持在3vvm[17]。發酵條件:優化后的最優發酵條件相同。每2h測定細菌數和芽孢量。

1.3 數據處理方法

實驗中圖表繪制采用 Microsoft Excel處理;正交實驗設計與方差分析應用軟件為正交設計助手v3.1[18]。

2 結果與分析

2.1 培養時間的確定

從圖1可以看出:隨著培養時間的延長,在0～3h內活菌數生長較慢,處于停滯期;而后迅速生長,3～18h細菌數內生長很快,到 18h活菌數接近頂峰,即這一階段是對數生長期,菌體數量急劇增多,活菌數迅速提高;18h以后活菌數有微降趨勢,但變化不大,即K-6-9已進入生長的穩定期。芽孢量在前9h變化不大,幾乎沒有增長,9～18h增長迅速,18～24h芽孢產量趨于穩定即進入平臺期。故本實驗選擇的最適合的發酵時間是18h。因此,實驗采用接種種齡為18h,此時枯草芽孢桿菌進入對數生長末期,既可保持高的細胞活力,又可獲得盡可能多的芽孢量。

圖1 枯草芽孢桿菌K-6-9生長曲線 Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis

2.2 枯草芽孢桿菌K-6-9培養基成分的優化

2.2.1 碳源的篩選 碳源的單因素篩選結果如圖2所示,當蔗糖作為碳源時,發酵后菌量最大,芽孢量達到1.50×106CFU/mL,其后芽孢量的大小依次為果糖>乳糖>棉籽糖>葡萄糖>麥芽糖>果葡糖漿。所以根據芽孢量數據,蔗糖應為最佳碳源。

圖2 不同碳源對 K-6-9發酵液的影響 Fig.2 Effects of different carbon source on the fermentation of K-6-9

2.2.2 氮源的篩選 對氮源進行單因素篩選,當胰蛋白胨作為氮源時,發酵后芽孢量最大,芽孢量達到1.94×106CFU/mL,其余根據芽孢量的大小依次為魚粉蛋白胨>牛肉膏>酵母粉>NH4NO3>NH4Cl>尿素(圖3)。根據芽孢量,胰蛋白胨應為最佳氮源。

圖3 不同氮源對K-6-9發酵液的影響 Fig.3 Effects of different nitrogen sources on the fermentation of K-6-9

2.2.3 無機鹽的篩選 對枯草芽孢桿菌K-6-9進行無機鹽單因素篩選,當KH2PO4作為無機鹽添加時,發酵后芽孢量最大,達到5.16×107CFU/mL,其余芽孢量大小依次為MgSO4>CaCl2>0.5%(W/V)NaCl>NaCl>不添加無機鹽>MnSO4(圖4)。

圖4 不同無機鹽對K-6-9發酵液的影響 Fig.4 Effects of different inorganic salts on the fermentation of K-6-9

綜合上述數據可以看出,KH2PO4和MgSO4、CaCl2在促進K-6-9發酵時,對芽孢量的生長有促進作用,NaCl對于芽孢量影響較小,后文不再考慮。根據芽孢量,CaCl2相比較KH2PO4和MgSO4影響較小,故選取KH2PO4和MgSO4作為無機鹽。

2.3 正交實驗優化比培養基成分

通過上述碳源、氮源以及無機鹽單因素實驗的研究,確定了液體發酵培養基的最佳碳源、氮源和無機鹽的種類和濃度范圍。按1.2.6設計的正交實驗優化培養基成分,確定最合適的培養基成分。

從表2可以看出,對枯草芽孢桿菌K-6-9生長影響因素的順序為胰蛋白胨>蔗糖>KH2PO4>MgSO4>CaCl2。實驗結果表明胰蛋白胨、蔗糖、MgSO4、KH2PO4對發酵效果影響較為顯著。實驗數據分析枯草芽孢桿菌K-6-9的最佳工藝組合為A3B1C1D2E3,即最佳培養基成分為蔗糖1.0%、胰蛋白胨0.25%、MgSO40.2%、KH2PO40.3%、CaCl20.1%、牛肉膏0.5%,芽孢產量為1.294×109CFU/mL。

由表3方差分析可以看出,胰蛋白胨、蔗糖、MgSO4、KH2PO4用量對芽孢產量的影響顯著,CaCl2影響不顯著,此結果與正交實驗結果的極差分析結論一致。

2.4 最佳培養條件的篩選

2.4.1 最佳接種量的確定 測定了1%、2%、3%、4%、5%、6%,6個接種量對芽孢量的影響。實驗結果表明接種量在一定范圍內增大芽孢量有所增加,但過量的接種量可能導致培養基養分提前消耗完,降低芽孢的數量[19]。實驗結果表明2%的接種量為最適接種量。

表2 枯草芽孢桿菌K-6-9 最適培養基成分L16(45)正交實驗結果Table 2 L16(45)orthogonal design and results for liquid medium optimization

表3 正交結果方差分析Table 3 Variance analysis of the results

圖5 接種量對芽孢產量的影響 Fig.5 Effect of seed volume on spore yield

2.4.2 最佳初始pH的確定 測定了5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、8.0,7個pH對芽孢量的影響。發酵培養基初始pH為 5.5～7.0時,與芽孢量增殖呈正相關:7.0～8.0 時呈負相關(圖7)。當pH為7.0時最適于芽孢量增殖。

圖6 初始 pH 對芽孢產量的影響 Fig.6 Effect of initial pH value of media on spore yield

2.4.3 最佳發酵溫度的確定 分別在不同溫度下進行發酵培養,結果表明發酵溫度為37℃最有利于芽孢量的增殖,綜上所述選擇37℃為本實驗最佳發酵溫度。

圖7 發酵溫度對芽孢產量的影響 Fig.7 Effect of temperature on spore yield

2.4.4 最佳轉速的確定 在所設的6個不同處理中,當搖床轉速為180r/min時,菌體產量明顯高于其他處理(圖9)。因此選擇180r/min作為本實驗的最佳轉速。

圖8 轉速對芽孢產量的影響 Fig.8 Effect of shaking speed on spore yield

2.5 擴大培養驗證實驗

在搖瓶的基礎上進行了5L的擴大培養,實驗結果如圖9。

圖9 枯草芽孢桿菌K-6-9擴大培養 在不同時間段活菌數、芽孢量和pH的變化 Fig.9 Amplification of Bacillus subtilis K-6-9 effect of fermentation time on living cell、spore yield and pH

通圖9可以看出,枯草芽孢桿菌擴大培養生長周期和搖瓶的時間周期有變化,可能由于通氣后加速了枯草芽孢桿菌K-6-9的生長,其在14h獲得了最大細菌數和芽孢量。發酵液的pH先由7.00 降低到5.83,后來逐漸上升到6.71。改良后發酵液的芽孢量為1.40×109CFU/mL相對于初始發酵培養基的芽孢量5.5×105CFU/mL,提高了2.55×103倍。

綜合上述實驗,得到優化后的發酵培養基配方為:蔗糖1.0%,胰蛋白胨0.25%,牛肉膏0.5%,MgSO40.2%,KH2PO40.3%,CaCl20.1%。確定了搖瓶的最佳培養條件:初始 pH 7.0,裝液量為 50mL/250mL,接種量為 2%,發酵溫度為 37℃,轉速為180r/min,發酵時間為 18h。搖瓶發酵芽孢量為1.32×109CFU/mL,發酵罐通氣量為3vvm,芽孢量為1.40×109CFU/mL。

3 討論

異甘露聚糖酶生產菌株K-6-9在批量生產制備成直投式發酵劑過程中最為重要的是以芽孢量為主要質量指標。因此,本研究以芽孢量作為該菌株發酵條件的評判指標。目前異甘露聚糖酶生產菌株發酵劑的應用國內外未見多報道,多為酶活力和制備甘露寡糖的研究。如王永[20]對于產異甘露聚糖酶菌株的復合誘變,張聞[6]等甘露聚糖酶產生菌F1-5的鑒定及發酵條件研究。王紹云[21]等采用由北京博仕奧生物技術有限公司提供,酶活≥ 20萬 U/g的內切型中性β-甘露聚糖酶對棕櫚粕進行酶解,得到以聚合度二、三、四、五為主的MOS等,對于發酵劑的研究較少。本實驗室分離的菌株K-6-9產異甘露聚糖酶的酶活性較強,固態培養基酶活力最高達601.6U/mL[23]。本實驗首次初步探討了異甘露聚糖酶K-6-9的高密度發酵,為后期制備直投式發酵劑提供了實驗基礎。

相對于其它枯草芽孢桿菌等高密度發酵,本實驗的芽孢量相對較少。這可能由于菌株的特殊性。 搖瓶發酵實驗表明K-6-9生長需要較好的溶氧條件,在其他發酵條件一定的情況下,培養基中的溶氧水平越高越有利于芽孢的產生。在后期的實驗中,將進行補料實驗以便進一步優化和提高芽孢量。

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