甘蔗醋高產(chǎn)菌株的篩選及鑒定

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(1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣州 510300；2.五華縣溢群酒業(yè)有限公司，梅州 514400；3.廣州甘蔗糖業(yè)研究所，廣州 510316)

近年來，食醋釀造朝著原料多樣化、產(chǎn)品功能化及多元化的趨勢(shì)發(fā)展[1]。果醋具有特殊風(fēng)味以及保健功效[2-3]，逐漸占有食醋市場(chǎng)的重要份額。釀醋菌種是釀醋工業(yè)的關(guān)鍵因素，直接影響到生產(chǎn)成本和產(chǎn)品品質(zhì)，國內(nèi)外研究者在釀醋菌種選育方面已積累了豐富成果，例如，滬釀1.01和中科AS1.41是我國食醋工業(yè)應(yīng)用已久的主要菌種[4-7]。然而，由于果醋原料繁多，果醋風(fēng)味和釀造工藝等方面可能對(duì)釀醋菌種有更高的要求，促使了一些研究者對(duì)果醋菌種開展選育工作[8-10]。

與其它果醋釀造原料相比，甘蔗具有資源豐富、風(fēng)味獨(dú)特、富含糖分及其它營養(yǎng)成分等優(yōu)點(diǎn)，是釀醋的良好原料。國內(nèi)研究人員已開展了一些關(guān)于甘蔗醋發(fā)酵工藝的研究，但仍沒有甘蔗醋釀造菌種篩選的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以自然發(fā)酵的甘蔗渣為篩選材料，對(duì)釀醋的高產(chǎn)菌株進(jìn)行篩選與鑒定，為甘蔗醋釀造提供優(yōu)良的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

自然發(fā)酵的甘蔗渣和甘蔗汁 五華縣酒業(yè)有限公司；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC31143 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；DNA提取試劑盒、16S rDNA的擴(kuò)增引物以及PCR擴(kuò)增試劑等 深圳華大基因科技服務(wù)公司；其它試劑 均為市售；富集培養(yǎng)基[11]葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，KH2PO42g/L，MgSO40.5g/L，調(diào)節(jié)pH5.0，121℃滅菌20min，冷卻至70℃加入3%無水乙醇；分離平板培養(yǎng)基[12]在富集培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)上，另加入瓊脂20g/L和CaCO320g/L；CaCO3需預(yù)先進(jìn)行干熱滅菌(160℃、30min)，與無水乙醇同時(shí)添加，盡量使之在培養(yǎng)基中均勻分布；斜面保藏培養(yǎng)基[12]組成同分離平板培養(yǎng)基。

SHZ-82A型恒溫水浴振蕩器 江蘇省太倉醫(yī)療器械廠；KDC-210HR高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；LC-10AD高效液相色譜儀 日本島津公司；A200基因擴(kuò)增儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；RDY-SP1Z核酸電泳儀 北京榮陽經(jīng)典科技有限公司；GI-1凝膠成像系統(tǒng) 通寶達(dá)成科技(北京)有限公司；S-3000N掃描電鏡 日本日立公司。

1.2 菌株富集培養(yǎng)及分離純化

將10g自然發(fā)酵的甘蔗渣加入100mL富集培養(yǎng)基中，置于30℃、150r/min的條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)24h；然后，吸取10mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入90mL新鮮的富集培養(yǎng)基，于相同條件下培養(yǎng)。如此轉(zhuǎn)接2次后，將培養(yǎng)液稀釋涂布在分離平板培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)48h，用竹簽挑取周圍具有較大的、透明圈清晰的菌落，接入斜面保藏培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)24h，置于4℃保藏，備用。

1.3 產(chǎn)酸發(fā)酵篩選

參照文獻(xiàn)提供的方法[13]，配制產(chǎn)酸發(fā)酵培養(yǎng)基。用蔗糖調(diào)節(jié)甘蔗汁糖度至160g/L，接入釀酒酵母CICC31143，置于30℃發(fā)酵至酒精度不再上升(殘留還原糖2.0g/L以下)，用無菌水調(diào)節(jié)酒精度至6%(v/v)，加入無菌的酵母膏5g/L，并用無菌的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH5.0，即得產(chǎn)酸發(fā)酵培養(yǎng)基。

將從分離平板挑取所得菌株的斜面菌種接入富集培養(yǎng)基，置于30℃、150r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，作為種子液。按10%的接種量，將種子液接入產(chǎn)酸發(fā)酵培養(yǎng)基，于30℃、150r/min下進(jìn)行發(fā)酵，至醋酸濃度不上升時(shí)結(jié)束。檢測(cè)發(fā)酵液的醋酸含量，根據(jù)產(chǎn)酸量篩選優(yōu)良菌株。

1.4 耐酒精特性篩選

采用無水乙醇或無菌水調(diào)節(jié)產(chǎn)酸發(fā)酵培養(yǎng)基的酒精至不同濃度，分別接入10%的種子液，于30℃、150r/min下進(jìn)行發(fā)酵，至醋酸濃度不上升時(shí)結(jié)束。檢測(cè)發(fā)酵液的醋酸含量，計(jì)算酒精轉(zhuǎn)化率，根據(jù)酒精轉(zhuǎn)化率篩選優(yōu)良菌株。酒精轉(zhuǎn)化率的計(jì)算如下式：

酒精轉(zhuǎn)化率(%)=發(fā)酵液中醋酸含量(g/L)/發(fā)酵液中初始酒精含量(g/L)×100

1.5 傳代穩(wěn)定性篩選

將上述篩選所得優(yōu)良菌株的斜面菌種轉(zhuǎn)接至新鮮斜面，置于30℃培養(yǎng)24h，再置于4℃保藏2周，然后進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)接及保藏，如此轉(zhuǎn)接10次。同時(shí)，每次轉(zhuǎn)接的斜面菌種都用于產(chǎn)酸試驗(yàn)。檢測(cè)發(fā)酵液的醋酸含量，比較各菌株的傳代穩(wěn)定性，從而優(yōu)選菌株。

1.6 優(yōu)選菌株的鑒定

參照文獻(xiàn)的革蘭氏染色顯微鏡觀察法和掃描電鏡觀察法[14]，鑒定菌種形態(tài)特征；參照文獻(xiàn)提供的方法[15-16]，鑒定菌種的生理生化特征；參照文獻(xiàn)提供的16S rDNA鑒定方法[17]，鑒定菌種的同源性。

在16S rDNA鑒定中，引物1和引物2分別采用5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′；反應(yīng)體系(50μL)為：10×Taq buffer 5.0μL，dNTP 1.0μL，模板 1.0μL，引物1和引物2各1.0μL，Taq酶0.5μL，ddH2O 39.5μL；PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳后，送至深圳華大基因科技服務(wù)公司測(cè)序，將獲得的序列在GenBank中進(jìn)行同源性檢索，并采用MEGA5.1軟件以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 測(cè)定方法

采用Lane-Eynon法[18]，測(cè)定還原糖含量；按國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T10345-2007，采用蒸餾法和酒精計(jì)法的結(jié)合方法[19]，測(cè)定乙醇含量；采用高效液相色譜法[20-21]，測(cè)定發(fā)酵液中的醋酸含量，其測(cè)定條件為：日本島津高效液相色譜儀LC-10AD，色譜柱Hypersil C18(4.6mm×150mm，5μm)，移動(dòng)相為0.002mol/L的硫酸溶液，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣10μL，檢測(cè)波長210nm。

在樣品檢測(cè)前，預(yù)先精密配制0.05、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40、0.50g/L的乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，按上述條件進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的乙酸含量(x)和峰面積(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)酵液經(jīng)10000r/min離心20min，取清液，經(jīng)適當(dāng)稀釋以及0.22μm濾膜過濾，按上述條件進(jìn)行測(cè)定，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算醋酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸發(fā)酵篩選

本實(shí)驗(yàn)高效液相色譜法所用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=32784.12x+648.36(相關(guān)系數(shù)R2=0.9996)，其中x為標(biāo)準(zhǔn)溶液的乙酸含量，y為峰面積。從分離平板上挑取到116株菌株，經(jīng)過產(chǎn)酸發(fā)酵試驗(yàn)，其中產(chǎn)酸量居前列的10株菌的發(fā)酵結(jié)果如圖1所示。由圖1看出，10株菌產(chǎn)酸量分布在32.8～41.8g/L的范圍內(nèi)，產(chǎn)酸量的排序?yàn)椋篊22>C63>C34>C08>C75>C20>C16>C78>C03>C41。其中，菌株C22、C63、C34和C08的產(chǎn)酸量均超過40g/L，其中菌株C22的醋酸產(chǎn)量達(dá)41.8g/L，故以上菌株均優(yōu)選為進(jìn)一步篩選的對(duì)象。

圖1 10株菌的產(chǎn)酸發(fā)酵結(jié)果 Fig.1 Acetic acid production of 10 strains

2.2 耐酒精性篩選

在不同起始酒精度的培養(yǎng)基中，菌株C22、C63、C34和C08的酒精轉(zhuǎn)化率如圖2所示。由圖2看出，起始酒精度對(duì)醋酸菌的發(fā)酵作用有一定的影響，隨起始酒精度的增加，4株菌的酒精轉(zhuǎn)化率均呈下降趨勢(shì)。各個(gè)酒精度下的酒精轉(zhuǎn)化率可以反映出菌株的耐酒精特性，尤其在較高酒精度的條件下，各菌株的酒精轉(zhuǎn)化率表現(xiàn)出較明顯的差距。結(jié)果表明，4株菌耐酒精性的排序?yàn)椋篊22>C34>C63>C08。其中，菌株C22在起始酒精度12%(v/v)下仍具有較強(qiáng)的發(fā)酵作用，其醋酸產(chǎn)量為62.2g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)65.7%。

圖2 不同酒精度下的酒精轉(zhuǎn)化率 Fig.2 Result of alcohol conversion rate on different ethanol degree

2.3 傳代穩(wěn)定性篩選

經(jīng)過10次傳代，4株菌在起始酒精度6%(v/v)的培養(yǎng)基中的發(fā)酵結(jié)果如圖3所示。菌株C22、C63、C34和C08產(chǎn)酸的波動(dòng)范圍分別為：40.6～42.4g/L、39.5～41.2g/L、39.4～41.0g/L和39.2～40.8g/L，10次傳代的產(chǎn)酸水平差距不大，表明各菌株具有良好的傳代穩(wěn)定性。同時(shí)，在各次傳代過程中，菌株C22產(chǎn)酸能力居于首位，故被確認(rèn)為最終優(yōu)選的菌株。

圖3 不同傳代次數(shù)的醋酸產(chǎn)量 Fig.3 Acetic acid production of different passage times

2.4 優(yōu)選菌株的鑒定

菌株C22的普通顯微鏡照片(16×100倍)和掃描電鏡照片(×12000倍)分別如圖4和圖5所示。菌體經(jīng)革蘭氏染色呈陰性反應(yīng)，形態(tài)呈短桿狀、單個(gè)或成對(duì)排列，菌體大小為(0.6～0.8)μm ×(1.6～2.0)μm。菌株C22的生理生化特征試驗(yàn)結(jié)果見表1，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》的描述，初步鑒定菌株C22為醋酸桿菌屬菌種。

圖4 菌株C22在普通顯微鏡下的菌體形態(tài) Fig.4 Cell morphology of strain C22 under ordinary microscope

菌株C22的16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1395bp，將此序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索以及進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列與許多巴氏醋酸桿菌(Acetobacterpasteurium)的16S rDNA序列的同源性達(dá)到100%，采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖6所示，其中菌株C22與巴氏醋酸桿菌(登錄號(hào)：AB753861)的親緣關(guān)系最接近。將菌株C22的形態(tài)、生理生化等特征與16S rDNA鑒定結(jié)果結(jié)合起來，可最終確定菌株C22為巴氏醋酸桿菌(Acetobacterpasteurium)。

圖5 菌株C22在掃描電鏡下的菌體形態(tài) Fig.5 Cell morphology of strain C22 under scanning electron microscope

表1 生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain C22

3 結(jié)論

以自然發(fā)酵的甘蔗渣為篩選材料，采用分離平板、產(chǎn)酸試驗(yàn)、耐酒精性試驗(yàn)以及傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)等方法，篩選獲得具有產(chǎn)酸高、耐酒精性強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定的菌株C22。菌株C22在12%(v/v)的酒精度下仍能夠表現(xiàn)出較強(qiáng)的發(fā)酵作用，在起始酒精度為6%(v/v)和12%(v/v)的培養(yǎng)基中，菌株C22的醋酸產(chǎn)量分別為41.8g/L和62.2g/L。經(jīng)過形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rDNA等方面的分析，鑒定菌株C22為巴氏醋酸桿菌。為了使菌株C22在甘蔗醋或其它果醋的釀造領(lǐng)域得到應(yīng)用，其發(fā)酵特性仍需進(jìn)一步研究。

圖6 菌株C22序列系統(tǒng)發(fā)育分析 Fig.6 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain C22

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