響應曲面法優化油茶餅粕蛋白的 超聲輔助提取工藝研究

，，，，

(中國林業科學研究院木材工業研究所,北京 100091)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)系山茶科山茶屬植物,是我國特有的重要食用油料作物。油茶餅粕是油茶果榨取茶油過程中產生的主要副產物,我國油茶餅粕的年產量約為40萬t[1]。由于油茶餅粕中單寧、茶皂素等溶血性物質含量較高,不適宜直接用于生產動物飼料,目前利用率不高,絕大部分基本上被廢棄[2]。有關文獻報道,油茶餅粕是一種營養價值較高的榨油工業副產品,含有豐富的蛋白質、單寧、茶皂素以及糖類化合物等有用成分,其中蛋白質含量最高,約為15%～18%[3-4],可作為蛋白飲料、沖調食品、焙烤食品的蛋白強化劑等的蛋白質原料,具有較高的經濟開發價值[5-9]。因而,對油茶餅粕蛋白的提取及科學有效利用,不僅可以抑制油茶餅粕資源的浪費,使油茶餅粕由“廢”變“寶”,也為人們獲取大量豐富的植物蛋白提供了一條新途徑。

目前關于油茶餅粕蛋白提取的研究很少,少數幾篇文獻報道主要是采用“堿提酸沉淀”方法獲得蛋白質,并通過正交實驗確定最佳提取條件,而傳統的正交實驗無法獲得影響因素與響應值之間明確的函數關系,從而無法獲得各因素的最佳組合及最優響應值[1,8-10]。另外,超聲波輔助法作為一種新興的提取方法,可實現各種動、植物有效含量的高效提取,雖然在油脂、多糖、香味等物質的提取中已有較廣泛的運用,但在油茶餅粕蛋白提取應用方面還未見報道。基于目前有關油茶餅粕蛋白提取方面研究的不足,本論文采用超聲波輔助復合溶劑法提取油茶餅粕中的蛋白,運用響應曲面法優化蛋白的提取工藝條件,建立提取工藝與油茶餅粕蛋白提取率之間的數學模型,并獲得最優的蛋白提取工藝參數,以期為油茶餅粕蛋白的高效提取和進一步開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶餅粕 油茶果榨取山茶油后產生的副產物,140～160目,呈棕褐色,含水率為6%～8%,由中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所提供;氫氧化鈉、無水碳酸鈉、碘化鉀、鹽酸、鹽酸羥胺甲醇、甲基紅 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

PHS-3B型多功能酸度計 上海精密科學儀器有限公司;JJ-1型精密增力電動攪拌器 金壇科析儀器有限公司;NH-4數顯恒溫水浴鍋 金壇榮華儀器制造有限公司;DHG-9140A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;CENTRIFUGE MODEL 2-40A型離心機 In Top Biolab.,Inc;FTS systems冷凍干燥機 德國Stone RIDGE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 油茶餅粕基本成分測定 水分含量測定,采用《糧食、油料檢驗水分測定法》(GB 5505-85);灰分含量測定,采用《糧食、油料檢驗灰分測定法》(GB 5505-85);粗脂肪含量的測定,采用《糧食、油料檢驗灰分測定法》(GB 5512-85);粗纖維含量的測定,采用《糧食、油料檢驗灰分測定法》(GB 5515-85);總糖量含量的測定,采用亞鐵氰化鉀滴定法[11];茶皂素、單寧的含量測定,根據已有文獻報道的方法[12-13];粗蛋白含量的測定,離心沉淀用凱氏定氮法,上層清液蛋白含量用Folin-酚法測定,以牛血清白蛋白為標準液。

1.2.2 油茶餅粕蛋白提取方法 油茶餅粕經干燥、粉碎后過140～160目篩子,用索氏提取裝置加石油醚除去油脂,低溫烘干。取100g脫脂的油茶餅粕粉加入4000mL體積分數為70%的乙醇水溶液,調節溶液的pH8～11,在30～60℃的水浴中進行超聲波提取,一段時間后過濾得濾液;將過濾殘渣再按“100g殘渣:4000mL乙醇水溶液”的比例進行二次、三次浸提。合并濾液并靜置過夜,然后再進行過濾,將濾液的上清液在4000r/min的速度下離心10min,用20%的HCl將離心后得到的上清液的pH調至4.2(蛋白等電點),待沉淀出現、穩定后,將沉淀物低溫冷凍干燥,最終得到油茶餅粕蛋白。

蛋白提取率(%)=(提取蛋白的質量/原料中含有的蛋白質量)×100

油茶餅粕蛋白提取的工藝流程如圖1。

圖1 油茶餅粕中植物蛋白的提取工藝流程 Fig.1 Technical process of protein extraction of oil-tea cake

1.2.3 響應曲面油茶餅粕蛋白提取實驗設計

1.2.3.1 提取工藝參數的確定 影響蛋白提取的因素主要有料液比(原料與提取溶劑的比)、提取時間、提取溫度、超聲波功率、提取介質的pH。一般提取時間越長,提取溫度越高,蛋白的提取率就越高。不過,當提取時間達到一定時長,蛋白提取率增加的幅度很小,甚至無明顯變化;而溫度提高到一定程度后,不但不會使蛋白的提取率增加,反而會造成蛋白提取率的下降,這是因為溫度過高致使蛋白變性析出,在過濾時將其濾出,故使得到蛋白的質量減少,提取率降低。伍曉春等對影響油茶餅粕蛋白提取率的提取時間、提取介質pH、料液比、提取溫度等工藝參數進行了研究探討[8]。實驗結果表明,在這四個影響因素中,對蛋白提取率影響的主次順序是pH、料液比、提取時間、提取溫度,并得出了這些工藝參數較合理的取值范圍:pH為9～11、提取時間為30～90min、提取溫度為35～60℃、料液比為1∶30～1∶50(優選為1∶40)[8]。目前,有關超聲波對油茶餅粕蛋白提取率的影響研究未見文獻報道,有少量報道是關于超聲波輔助其他植物蛋白提取的研究,一般將超聲波的功率選擇在150～450W。

1.2.3.2 提取工藝實驗設計方案 根據提取時間、提取介質pH、料液比、提取溫度、超聲功率等工藝條件對油茶餅粕蛋白提取率影響的主次因素以及對應工藝參數的合理取值范圍,本實驗選用提取溫度、提取時間、超聲波功率和介質pH作為影響油餅粕蛋白提取率的考察因素,以+1、0、-1分別代表高、中、低水平,料液比選為1∶40,各實驗因素水平與編碼見表1。采用中心組合旋轉設計(CCRD)原理,以油茶餅粕蛋白提取率為響應值,利用Design Expert 7.0.0軟件設計了四因素三水平的響應曲面分析實驗,共31個實驗點,其中24個析因點,7個零點,通過零點實驗估計誤差,并對實驗結果進行分析,建立二次多項式數學模型,求解出油茶餅粕蛋白提取率最大值。

表1 實驗因素水平和編碼Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.4 油茶餅粕蛋白提取工藝的驗證 為了驗證通過響應曲面優化得出的最佳提取工藝條件及其預測提取率的準確性和有效性,在最佳工藝下進行3次驗證實驗,并將平均值作為最終的結果。

2 結果與分析

2.1 油茶餅粕基本成分分析

根據國家標準中規定的實驗方法,對油茶餅粕的基本組成成分進行定量檢測。如表2所示,油茶餅粕中主要含有16.8%粗蛋白,35.4%總糖量,13.5%粗纖維,11.7%茶皂素,8.3%單寧，3.4%粗脂肪，8.2%水分以及2.7%其它成分,其中粗蛋白含量較高,僅次于總糖量,完全有價值進行蛋白提取,其營養價值有待開發。另外,油茶餅粕中還含有茶皂素和單寧兩大抗營養成分,這正是油茶餅粕不能直接利用作為動物飼料的主要原因。

表2 油茶餅粕基本成分的組成及其含量Table 2 Components of oil-tea cake

2.2 響應面實驗結果分析

2.2.1 響應曲面結果的方差分析 響應曲面法實驗設計方案及結果見表3。運用Design Expert 7.0軟件對數據進行分析,其方差分析結果見表4。由表4中的方差分析可知,X1、X2、X3、X4、X12、X22、X32、X42對油茶餅粕蛋白提取率的影響極其顯著,說明提取時間、提取溫度、介質pH、超聲功率是油茶餅粕蛋白提取過程中的重要控制因素,而它們之間的交互效應不顯著。從表4中F值的大小可以看出,在提取時間、提取溫度、超聲功率、介質pH四個因素中,對油茶餅粕蛋白提取率的影響的主次順序依次是介質pH、超聲功率、提取時間、提取溫度。失擬項的p值為0.1946,沒有顯著性意義,說明數據中沒有異常點,數據準確可靠。

表3 響應曲面實驗方案與結果Table 3 Response surface results of extraction process of oil-tea cake protein

2.2.2 油茶餅粕蛋白提取工藝的回歸模型方程建立 運用SPSS軟件對表3和表4中的結果進行統計分析,建立以X1、X2、X3、X4為自變量,油茶餅粕蛋白提取率為響應值的二次多項回歸方程:

Y=69.84+3.08X1+2.18X2+4.93X3+5.21X4-0.61X1X2+0.31X1X3-0.08X1X4-0.22X2X3+0.32X2X4-0.02X3X4-5.61X12-4.96X22-6.22X32-7.85X42

其中Y為油茶餅粕蛋白的提取率,X1、X2、X3和X4分別為提取時間、提取溫度、超聲功率和介質pH的編碼值。

為了驗證二次回歸模型的可信性,分別對模型的決定系數、校正決定系數、變異系數等特征參數進行分析,結果見表5。

表5 回歸模型的可信度分析Table 5 Fit statistics of regression equation

由表5可以看出,回歸方程的F值為32.7307,大于F值的概率(Pr>F)為<0.0001,說明回歸方程本身對蛋白提取率的影響是顯著的。失擬項反映的是實驗數據與模型不相符的情況,本方程的失擬項p不顯著(見表4),表明方程對實驗擬合性良好,實驗誤差小。由模型可信度分析表可知,回歸方程的決定系數R=0.9663,說明模型方程可以解釋96.63%的實驗所得油茶餅粕蛋白提取率的變化,表明方程擬合性好。決定系數和校正決定系數相近,信噪比大于4,這均說明擬合方程可靠,準確。變異系數(CV)表示實驗的精確度,CV值越高,實驗的可靠性越低[2]。本實驗設計中CV為6.5228%,說明實驗有較好的精確度和可靠性,可以用該回歸方程代替真實實驗點對實驗結果進行分析和預測。

2.2.3 最佳提取工藝的確定及驗證 利用2.2.2節中獲得回歸方程,分別對X1、X2、X3、X4進行求偏導,在實驗范圍內尋求出油茶餅粕蛋白的最大提取點及最佳工藝條件,即提取時間為68min、提取溫度為48℃、介質pH為10、超聲功率350W,模型預測的提取率為72.4%。

表4 響應曲面結果的方差分析Table 4 Variance analysis of response surface results

為了驗證回歸方程模型的可靠性,在最佳優化提取條件下進行三次平行實驗,實驗結果顯示,三次實驗提取率分別為71.8%、72.0%、72.1%,平均提取率為71.97%,與模型預測的理論值的誤差僅為0.6%,說明該回歸方程能真實地反映各篩選因素對油茶餅粕蛋白提取率的影響,證明用響應曲面法尋求最佳蛋白提取工藝是較為可靠的。與通過正交方法優化蛋白提取工藝相比,采用超聲波輔助法提取油茶餅粕中蛋白可顯著提高油茶餅粕蛋白的提取量,說明本超聲波輔助提取油茶餅粕蛋白是一種高效的植物蛋白提取方法。

3 結論

本研究通過測定油茶餅粕的基本組成成分,明確了餅粕中含有可觀的植物蛋白,其營養價值有待開發。采用響應曲面法對超聲波輔助復合溶劑提取油茶餅粕蛋白的工藝條件進行優化,通過建立油茶餅粕蛋白提取率(Y)與提取時間、提取溫度、介質pH和超聲功率之間的二次多元回歸模型,求解出最優油茶餅粕蛋白提取工藝條件為:提取時間68min、提取溫度48℃、介質pH10、超聲功率350W,模型預測提取率為72.4%。在該工藝條件下通過三次平行實驗獲得的平均提取率為71.97%,與模型預測的理論值的誤差僅為0.6%,說明該回歸方程是合理可靠的,能較好地預測油茶餅粕蛋白的提取率,具有實用價值。

[1]林秀椿,高剛峰,陳美高,等.油茶餅粕蛋白提取及抗氧化酶解產物的制備[J].食品工業科技,2011,32(1):219-270.

[2]胡龍,吳雪輝,李葉青,等.響應面法優化油茶餅粕發酵生產單細胞蛋白的工藝研究[J].食品工業科技,2012,33(13):249-253.

[3]姜偉,余勃,陸豫. 油茶粕中油茶皂苷提取純化工藝研究[J].食品科學,2008,29(9):242-244.

[4]鄧桂蘭,彭超英,盧峰. 油茶餅粕的綜合利用研究[J]. 廣州食品工業科技,2005,20(3):130-132.

[5]Fan D B,Qin T F,Wang Ch P,etal. Evaluation of Forestry Residue-source Oil-tea Cake as an Extender for PF Plywood Adhesive. Forest Products Journal,2010,60(7/8):610-614.

[6]朱培,鐘海雁,鄭菲. 不同油茶餅粕的營養成分比較與飼用可行性分析[J].經濟林研究,2011,29(1):90-93.

[7]劉曉庚. 油茶果及茶枯餅中氨基酸的分析研究[J]. 陜西糧油科技,1995,20(4):46-48.

[8]伍曉春,熊筱娟,陳武. 油茶餅粕中植物蛋白的提取分析[J]. 宜春學院學報,2008,30(4):29-30.

[9]丁丹華,彭光華,夏輝,等. 油茶籽粕蛋白提取工藝研究[J]. 食品科學,2010,31(8):102-105.

[10]馬力,陳永忠,彭邵鋒,等. 油茶枯餅生產蛋白飼料發酵工藝條件的研究[J]. 農產品加工(學刊),2012,2:9-14.

[11]李鳳玉.用鐵氰化鉀法測定王漿中總糖的含量[J].養蜂科技,2005,3:5-6.

[12]徐曼,陳笳鴻,汪詠梅,等.油茶果殼單寧成分的提取及其分析[J].實驗初報,2009,29(增刊):187-191.

[13]李靜,李燕,黨培育.茶皂素的提取及純化研究[J]. 食品科技,2008,29(11):154-156.