酶解酸棗仁蛋白制備抗氧化肽的研究

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇徐州 221000)

酸棗仁為鼠李科植物酸棗(Zizyphusjujubavar.sapinosa)的干燥成熟種子，為衛(wèi)生部認定的藥食同源的物品之一。酸棗仁營養(yǎng)成分豐富，富含脂肪酸、蛋白、碳水化合物等營養(yǎng)素，其中蛋白含量約占36%，蛋白中含人體所需的17種氨基酸[1]。目前國內(nèi)外對酸棗仁的研究主要集中于生物堿[2-3]、皂苷[4]和黃酮[5]等化學成分及藥理功能上，對于酸棗仁蛋白的研究極少，而有關利用酸棗仁蛋白酶解制備抗氧化肽工藝的研究未見報道。通過蛋白質(zhì)的可控酶解技術制備抗氧化肽，是蛋白質(zhì)類物質(zhì)中最有前途的抗氧化物質(zhì)[6]。利用酶解技術生產(chǎn)抗氧化肽的研究已引起了人們的廣泛關注，有關大豆[7]、玉米[8]、小麥[9]等蛋白來源的抗氧化肽已有較多報道。蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性受到酶解pH、溫度、底物濃度、酶與底物濃度比、時間等因素的影響，因此需要對酶解條件進行優(yōu)化。本課題以酸棗仁為原料，對Alcalase蛋白酶酶解酸棗仁蛋白制備抗氧化肽的工藝進行研究，旨在為高活性酸棗仁抗氧化肽的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁 安徽亳州藥材市場；Alcalase蛋白酶 丹麥NovoNordisk公司惠贈；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) Sigma公司；其它試劑為分析純。

723G分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；PHS-2C精密酸度計 上海精科雷磁儀器廠；FA2104N電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋 河南智成科技發(fā)展有限公司；FFC-23型萬能粉碎機 江陰萬通藥化機械設備廠；TGL-16-B高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;R201L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 酸棗仁蛋白的制備

將粉碎好的酸棗仁粉置于3倍體積(m/V)的石油醚中，于38℃恒溫水浴攪拌30min，室溫3000r/min離心10min去除溶劑。重復3次，基本除去酸棗仁粉中的油脂，過40目篩，得到均一的脫脂酸棗仁粉。稱取100g脫脂酸棗仁粉，以一定比例的蒸餾水溶解(液料比24∶1)，調(diào)節(jié)pH11，在57℃下攪拌浸提46min。離心(3000r/min、20min)得上清液，調(diào)節(jié)pH至酸棗仁蛋白的等電點pH4.0，于4℃靜置2h，得到蛋白沉淀。重新懸浮沉淀，調(diào)節(jié)pH至7.0，4℃透析48h脫鹽。脫鹽后的蛋白溶液冷凍干燥后得酸棗仁蛋白。

1.3 酸棗仁蛋白的酶解工藝

稱取適量酸棗仁蛋白溶于30mL去離子水中，用0.5mol/L的NaOH溶液調(diào)酶解pH，混勻。將所得溶液放置入恒溫水浴鍋中，緩慢攪拌的同時加入適量Alcalase 堿性蛋白酶，通過滴加0.5mol/L的NaOH溶液來維持pH不變。到所需反應時間后將酶解液置于沸水中滅酶10min，抽濾，濃縮，冷凍干燥得酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物，酶解產(chǎn)物溶于一定量蒸餾水后測量DPPH自由基清除率。

1.4 DPPH自由基清除率測定

參照Oyaizu[10]報道的方法，稱取適量酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物溶于1.5mL的去離子水中，振蕩使其充分溶解，再加入1.5mL含0.1mmol/L DPPH·的95%乙醇，混合、振蕩，在室溫下避光放置30min，然后在波長517nm處檢測吸光度。

清除率計算公式如下：

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式中：Ac-為對照組吸光值，1.5mL蒸餾水加1.5mL含0.1mmol/L DPPH·的95%乙醇；Ai-為樣品組吸光值，1.5mL樣品液加1.5mL含0.1mmol/L DPPH·的95%乙醇；Aj-為空白組吸光值，1.5mL樣品液加1.5mL 95%乙醇。

1.5 單因素試驗

考察酶解溫度、底物濃度、酶與底物濃度比([E]/[S])、pH、酶解時間對DPPH·清除率的影響。

酶解溫度考察的水平分別為40、45、50、55、60℃，其他酶解條件底物濃度、[E]/[S]、pH、時間分別為3%、2%、8.0、30min。

底物濃度考察的水平分別為1%、2%、3%、4%、5%，其他酶解條件溫度、[E]/[S]、pH、時間分別為50℃、2%、8.0、30min。

[E]/[S]考察的水平分別為1%、2%、3%、4%、5%，其他酶解條件溫度、底物濃度、pH、時間分別為50℃、3%、8.0、30min。

酶解pH考察的水平分別為7、7.5、8、8.5、9，其他酶解條件溫度、底物濃度、[E]/[S]、時間分別為50℃、3%、2%、30min。

酶解時間考察的水平分別為20、30、40、50、60min，其他酶解條件為溫度、底物濃度、[E]/[S]、pH分別為50℃、3%、2%、8.0。

1.6 Box-Behnken試驗設計

在單因素試驗的基礎上，確定酶與底物濃度比4%，酶解時間40min。采取Box-Behnken中心組合試驗設計，以酶解溫度(x1)、pH(x2)和底物濃度(x3)為自變量，以DPPH自由基清除率為響應值，安排三因素三水平試驗，各個因素水平編碼值見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.7 酶解產(chǎn)物氨基酸組成的分析

酸水解法(6mol/L HCl于110℃水解24h)分析酶解產(chǎn)物的氨基酸組成[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解溫度對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 酶解溫度對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響見圖1，清除率隨酶解溫度的增加先升高后降低，在酶解溫度為50℃時，酶活最高，酶解物得率較高，清除率相對較高，溫度大于50℃后，酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力下降，可能的原因是酶活受到抑制，酶解產(chǎn)物得率急劇下降，故選擇較優(yōu)酶解溫度為50℃。

圖1 酶解溫度對酸棗仁蛋白酶解物清除 DPPH自由基的影響 Fig.1 Effect of temperature on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.1.2 底物濃度對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 不同底物濃度下的清除率見圖2，清除率隨著底物濃度的增加而增加，而當?shù)孜餄舛瘸^4%時，DPPH自由基清除率增幅緩慢，這是因為底物濃度已過量，考慮到生產(chǎn)成本，故確定底物濃度為4%。

圖2 底物濃度對酸棗仁蛋白酶解物清除 DPPH自由基的影響 Fig.2 Effect of substrate concentration on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.1.3 酶與底物濃度比([E]/[S])對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 酶與底物濃度比([E]/[S])對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響如圖3所示，清除率隨著[E]/[S]的增加而增加，[E]/[S]為4%和5%下的清除率基本保持一致。其原因是在底物過飽和時，增加酶量可以提高酶與底物的結(jié)合，從而加快酶促反應速率，當酶量增加到一定值后，酶分子趨向飽和，此時繼續(xù)增大酶量對反應速率貢獻不大[11]。故確定[E]/[S]為4%。

圖3 酶與底物濃度比([E]/[S]) 對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 Fig.3 Effect of [E]/[S] on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.1.4 pH對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 圖4為pH對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響。清除率隨pH的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，當pH為8.0時，酶活最高，得到的酶解產(chǎn)物最高，清除率最高，故選較優(yōu)pH為8.0。

圖4 pH對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 Fig.4 Effect of pH on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.1.5 酶解時間對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 圖5為酶解時間對清除率的影響，清除率隨酶解時間的增加逐漸升高，酶解時間在20～40min之間，清除率顯著增加，當超過40min后，底物幾乎完全被酶解，清除率趨于平緩，故確定酶解時間為40min。

圖5 酶解時間對酸棗仁蛋白酶解物清除 DPPH自由基的影響 Fig.5 Effect of time on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.2 Box-Behnken試驗設計

在單因素試驗的基礎上，確定[E]/[S]為4%，酶解時間為40min，選取酶解溫度、pH、底物濃度三個因素安排Box-Behnken試驗設計，結(jié)果如表2所示。

表2 試驗設計及結(jié)果Table 2 Design and results of experiments

2.2.1 回歸模型的建立與檢驗 對表2試驗數(shù)據(jù)用多元回歸擬合后，得到清除率(Y)與酶解溫度(x1)、pH(x2)和底物濃度(x3)的回歸方程：

Y=-3175.392+34.293x1+596.521x2-7.402x3-1.317x1x2+0.452x1x3+0.435x2x3-0.252x12-32.916x22-4.047x32

對該回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance with regression model

對表3回歸模型系數(shù)的顯著性分析可見，一次項中，x2、x3極顯著(p<0.01)，x1達到顯著水平(p<0.05)；平方項的回歸系數(shù)均極顯著，說明各因素與清除率之間存在明顯的二次關系；二次項中x1x2的回歸系數(shù)均達到極顯著水平(p<0.01)，x1x3的達到顯著水平(p<0.05)，表明酶解溫度和pH、酶解溫度和底物濃度之間的交互作用對酶解產(chǎn)物的清除率有顯著影響。

2.2.2 兩因素間的交互效應分析 固定一個因素在零水平上，研究另兩個因素間的交互效應。

固定底物濃度于零水平時，繪出酶解溫度和pH的交互效應的響應面，如圖6a清除率隨酶解溫度和pH的變化會產(chǎn)生較大變化，隨著酶解溫度和pH的增加，清除率明顯呈現(xiàn)出先增后減的趨勢。若要獲得較高的清除率，酶解溫度應該在50.0～52.5℃之間，pH應該在8.0～8.3之間。在不同的酶解溫度水平下，隨著pH的增大，清除率變化的程度不同；在不同的pH水平下，隨著酶解溫度的增加，清除率變化的程度亦不同。

圖6b為酶解溫度和底物濃度的交互效應的響應面。若要獲得較高的清除率，酶解溫度應該在50.0～52.5℃之間，底物濃度應該在4.5%～5.0%之間，底物濃度對清除率的影響較酶解溫度更為敏感。

圖6 試驗因素交互作用對酸棗仁蛋白酶解物清除 DPPH自由基的影響 Fig.6 Interactive effect of three factors on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.2.3 最佳條件優(yōu)化及驗證結(jié)果 通過所得回歸模型對提取工藝進行優(yōu)化，得出最佳提取工藝條件為酶解溫度51.2℃、酶解pH8.1、底物濃度4.7%，在此條件下清除率的最大理論值為91.59%。對此優(yōu)化條件進行驗證，實測清除率為91.54%，與預測值基本一致，表明該回歸模型具有較好的預測性能，可用于指導生產(chǎn)實踐。

2.3 酶解產(chǎn)物氨基酸組成分析

酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的氨基酸組成見表4，由表4可知，酶解產(chǎn)物共含有17種氨基酸，其中富含脯氨酸、甘氨酸和谷氨酸，蛋氨酸含量較低，脯氨酸和甘氨酸殘基能表現(xiàn)出較好的抗氧化性[12]。此外，總疏水基氨基酸的含量高達48.440%，而總疏水基氨基酸的含量與抗氧化能力呈正相關性[13]。

表4 酶解產(chǎn)物氨基酸組成Table 4 Amino acid composition analysis of enzymatic hydrolysate

3 結(jié)論

以DPPH自由基清除率作為指標評價了酸棗仁蛋白酶解物的抗氧化活性，在單因素試驗的基礎上，確定[E]/[S]為4%，酶解時間為40min后，通過Box-Behnken試驗設計建立了DPPH自由基清除率與酶解溫度、酶解pH和底物濃度的二次多項式模型，最佳制備工藝參數(shù)為酶解溫度51.2℃、酶解pH8.1、底物濃度4.7%，在此條件下清除率的最大理論值為91.59%。此模型在試驗范圍內(nèi)能較準確地預測酸棗仁蛋白酶解物對DPPH自由基的清除率。酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物富含脯氨酸、甘氨酸和谷氨酸。

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