雅致小克銀漢霉的復合酶破壁工藝研究

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(1.南京工業大學生物與制藥工程學院,江蘇南京210009;2.南京工業大學國家生化中心,江蘇南京211816)

γ-亞麻酸(γ-linolenic acid,GLA)分子式為C18H30O2,分子量為 278,它是無色油狀液體,不溶于水,易溶于石油醚、正己烷等非極性溶劑中,在高溫條件下極易氧化。 GLA是一種ω-6多不飽和脂肪酸[1-2],具有廣泛的生理活性和明顯的藥理作用。GLA可以降血脂,抗糖尿病,抗腫瘤,抗血栓性心腦血管疾病,預防和治療高血壓、動脈粥樣硬化等[3]。GLA 還可增強人體的免疫功能,它是嬰兒不可缺少的營養素之一[4]。人和哺乳動物自身卻不能合成GLA,一般從天然植物中獲得,但遠不能滿足人們的需求。在某些藻類和真菌中含有豐富的GLA,真菌發酵產GLA具有生產周期短、不受自然條件限制、占地面積小、產量穩定和含油量穩定等優點,因而現在利用真菌發酵生產亞麻酸已成為國際趨勢。1986年日本和英國就能用微生物提取亞麻酸進行工業化生產,目前我國還處于研究階段,加大力度研究微生物工業化提取亞麻酸的方法是目前研究亞麻酸的一個重要方面[5]。

GLA為胞內產物,因而必須對細胞進行破壁處理,選擇合適的破壁方法可最大限度的將GLA提取出來。目前,研究者常采用的油脂提取方法主要有索氏抽提法、機械法、有機溶劑浸提法、酸熱法、超臨界CO2萃取法等[6-7]。索氏法的油脂得率最高,但耗時較長,用量大;超臨界CO2萃取法油脂得率較索氏法略低,油脂的脂肪酸組成及含量相近,且樣品需要量小,樣品處理能力較索氏法大為提高,但需相應設備;有機溶劑法提取效果最差;酸熱法效果較好,操作簡便,但更多用于菌株篩選。目前工業中仍以經球磨機或高壓勻漿處理菌體后再用有機溶劑提取的方法為主,但該方法耗能高、噪聲大、并且破壁過程中容易積聚大量的熱量,易對GLA造成損失。因而,尋找一種高效、節能的GLA提取工藝顯得尤為重要。酶法破壁相對于傳統破壁手段具有反應條件溫和、能耗低、環保等優點,近年來已有許多相關文獻的報道。萬紅貴[8]等用纖維素酶和蛋白酶復合處理三孢布拉霉優化番茄紅素提取率。根據雅致小克銀漢霉的細胞壁結構特征,本文研究采用堿性木聚糖酶和堿性蛋白酶復合處理雅致小克銀漢霉的實用效果,旨在為工業化生產提供相應的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雅致小克銀漢霉(Cunninghamella elegans) 本實驗室保藏菌株;堿性蛋白酶(酶活為50000u/g)、堿性木聚糖酶(酶活為35944u/mL) 諾維信中國生物技術有限公司;氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、石油醚、正己烷、乙醇 國藥集團化學試劑公司,分析純;去離子水 同凱兆業;GLA標準品 南京奧青生物有限公司,色譜純。

JJ-1電動攪拌器 常州國華電器有限公司;LG10-2.4A高速離心機 北京醫用離心機廠;KH2200B超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司;RE-85C旋轉蒸發儀 上海青浦滬西儀器廠;GZX-9140 MBE電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;SHB-S循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;HH-2恒溫水浴鍋 金壇市恒豐儀器廠;BS124S電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;GC112A-1氣相色譜儀 上海舜宇恒平設備有限公司;SPB-3空氣泵 北京中惠普分析技術研究所;SPH-300氫氣泵 北京中惠普分析技術研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 分析方法

1.2.1.1 GLA含量測定 分別選取濃度為1、2、3、4、5mg/mL GLA標準品作為橫坐標,峰面積為縱坐標,得到標準曲線。利用外標法,將樣品的峰面積代入,即可得到樣品GLA的含量。

1.2.1.2 菌體含水量測定 稱取一定量GLA濕菌絲體置入80℃烘箱中烘至恒重,計算菌體含水量。菌體含水量計算公式如下

式(1)

式中,η為含水量,M為濕菌體質量,m為烘干后菌體質量。

1.2.1.3 GLA提取率的計算 稱取一定量GLA濕菌絲體置入80℃烘箱中烘至恒重,機械破碎后以石油醚作為提取劑進行索氏提取,索提時間為8h,索提結束后用旋轉蒸發儀將提取溶劑蒸發掉,得到的油脂甲酯化后,經氣相色譜檢測,得到GLA的含量。

稱取一定量小克銀漢霉濕菌絲體,按照不同方法對其進行處理后,加入適量的正己烷和乙醇提取GLA,之后用旋轉蒸發儀將提取溶劑蒸發掉,得到的油脂甲酯化后,經氣相色譜檢測,即可得到GLA的含量。由此可得到提取率的計算公式為:

提取率(%)=一定量的濕菌體經不同方法處理后得到的GLA的量/相同量的濕菌體經素提后得到的GLA的量×100

式(2)

1.2.2 實驗設計 稱取一定量的雅致小克銀漢霉菌絲體,在一定條件下加入一定的復合酶酶進行酶解反應,反應結束后加入一定量的正己烷和乙醇提取GLA,采用氣相檢測GLA并按式(2)計算提取率,考察實驗過程中復合酶的添加量、酶解溫度、酶解時間、酶解pH等因素,獲得最佳的破壁工藝。

1.2.3 復合酶各因素實驗方法

1.2.3.1 酶添加量對GLA提取的影響 稱取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05g復合酶(堿性蛋白酶與堿性木聚糖酶質量比為1∶1),溶于30mL去離子水中,加入到10g雅致小克銀漢霉濕菌絲體(含水量為η)中。對照實驗用30mL去離子水代替。自然pH條件下,在50℃恒溫水中反應4h后用正己烷-乙醇混合溶劑提取(V正己烷∶V乙醇=4∶1)。收集提取液,測定GLA含量,計算提取率。

1.2.3.2 酶解pH對GLA提取的影響 稱取0.03g復合酶,溶于30mL去離子水中,加入到10g小克銀漢霉濕菌絲體中,分別調節菌絲體pH,為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。在50℃恒溫水中反應4h后用正己烷-乙醇混合溶劑提取。收集提取液,測定GLA含量,計算提取率。

1.2.3.3 酶解溫度對GLA提取的影響 稱取0.03g復合酶,溶于30mL去離子水中,加入到10g雅致小克銀漢霉濕菌絲體中,均調節pH為9.0。分別在35、40、45、50、55、60℃恒溫水中反應 4h后用正己烷-乙醇混合溶劑提取。收集提取液,測定GLA含量,計算提取率。

1.2.3.4 酶解時間對GLA提取的影響 稱取0.03g復合酶,溶于30mL去離子水中,加入到10g雅致小克銀漢霉濕菌絲體中,均調節pH為9.0。在50℃恒溫水中反應1、2、3、4、5、6h后用正己烷-乙醇混合溶劑提取。收集提取液,測定GLA含量,計算提取率。

表1 正交實驗表Table 1 The orthogonal experimental design

2 結果與討論

2.1 GLA標準曲線測定

由實驗得GLA標準曲線的回歸方程為Y=2112.806X-155.4546,相關系數R2=0.99726。

2.2 復合酶破壁單因素實驗

2.2.1 酶添加量對GLA提取的影響 由圖1可知,隨著復合酶的添加,GLA的提取率與對照相比有了明顯提高,但隨著復合酶的量增加,提取率提高的幅度越來越不明顯,出于考慮經濟等因素,酶的添加量選擇0.03g,即相對于濕菌體來說,酶的添加量為0.3%為宜。

圖1 酶添加量對GLA提取的影響 Fig.1 Effect of addition of enzyme on GLA extraction

2.2.2 酶解pH對GLA提取的影響 由圖2可知,當pH為9時,復合酶的破壁效果最好,GLA提取率為86.2%。這是由于pH為9時復合酶的綜合活性最佳,能最大程度上破壞雅致小克銀漢霉的細胞壁,這使得萃取劑能夠很好地和胞內的GLA接觸,將其提取出來。在其他pH范圍內,復合酶的活性受到不同程度的抑制,使得提取率有著不同幅度地下降。

圖2 酶解pH對GLA提取的影響 Fig.2 Effect of different pH on GLA extraction

2.2.3 酶解溫度對GLA提取的影響 如圖3所示,在較低溫度時,提取率隨著溫度升高而升高,當溫度超過50℃時,提取率則隨著溫度升高而有所降低。這是因為在較低溫度時難以發揮出復合酶的全部活力,而溫度太高又容易使復合酶變性,抑制其活性,故酶解最佳溫度選擇50℃。

圖3 酶解溫度對GLA提取的影響 Fig.3 Effect of different temperature on GLA extraction

2.2.4 酶解時間對GLA提取的影響 由圖4可知,隨著時間增加,GLA提取率有明顯地提高,但是當酶解4h過后,隨著時間的增加,GLA的提取率則無明顯增加,綜合考慮經濟等因素,酶解時間為4h,此時提取率達到87.3%。

圖4 酶解時間對GLA提取的影響 Fig.4 Effect of enzymolysis time on GLA extraction

2.2 復合酶破壁正交實驗

由單因素實驗可知,酶解pH、酶解溫度、酶解時間可能會產生相互影響,有必要對提取工藝進行正交優化。在固定酶添加量的前提下,綜合考察酶解pH、酶解溫度、酶解時間等單因素,通過正交實驗優化出最佳提取工藝。

由正交實驗數據表可知,各因素對結果影響都不顯著,但正交實驗數據仍有意義。復合酶對雅致小克銀漢霉破壁的極差大小順序為C>B>D>A,即影響破壁效果的4個因素的主次順序為酶添加量、酶解pH、酶解時間、酶解溫度。表中最佳的組合為A1B2C2D2,而根據k值分析,最優組合為A2B2C2D2。將這兩個組合實驗進行驗證實驗,GLA提取率分別為77.8%和87.3%,故組合A2B2C2D2為最佳組合,即復合酶添加量為0.3%、酶解pH為9、酶解溫度為50℃、酶解時間為4h為本文最佳條件。

表2 正交實驗數據表Table 2 The orthogonal experimental result

表3 方差分析Table 3 The analysis of variance

3 結論

酶破壁法具有反應條件溫和,能耗低,環保等特點,更適于工業化生產,與傳統工藝相比,節約了成本,降低能耗,符合國家倡導的“低碳經濟”等主題,具有積極的意義。

本文通過單因素和正交實驗,得到最佳的復合酶破壁工藝條件為:復合酶添加量為0.3%、酶解pH為9、酶解溫度為50℃、酶解時間為4h,在此條件下GLA提取率達到87.3%。上述實驗數據可為GLA工業化生產起一定的參考作用。

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