響應面法優化魷魚纏卵腺糖蛋白 提取工藝研究

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(1.福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002;2. 福建省水產研究所,福建廈門 361013)

魷魚營養豐富,富含多種人體必需氨基酸,是一種高蛋白、低脂肪、低熱量,深受人們喜愛的水產品。其含有多種人體必需的氨基酸,且必需氨基酸組成接近全蛋白[1],具有緩解疲勞、滋補、抗衰老、抗氧化、養顏等作用。近年來,魷魚加工產量日益擴大,但在加工過程中一般僅對其酮體進行加工,產生50%左右的內臟等副產物,其中生殖腺(纏卵腺、精巢、卵巢等)占了魷魚內臟的20%～30%。魷魚加工副產物中含有大量具有高價值、含量大的功能活性成分,現已逐漸被開發和高值化利用,如林彩平等[2]以魷魚內臟為原料,研究了酶法提取魷魚肝油的生產工藝;宋茹等[3]采用酶解法提取了魷魚墨囊中的墨黑色素;章建設等[4]從魷魚內臟中提取了糖蛋白,具有一定的免疫活性。纏卵腺在頭足類中普遍存在,位于直腸兩側內臟囊壁上,墨囊的兩側,呈白色卵狀,與頭足類的生殖活動密切相關[5]。國內外對于頭足類纏卵腺的研究很少。Yu等[6]在柔魚Ommastrephid squid的纏卵腺中發現一種特殊的海洋粘蛋白,用制成高保濕和皮膚保護的化妝品。糖蛋白是一類由寡糖鏈與肽鏈中的一定氨基酸殘基以糖苷鍵共價連接而成的蛋白質,具有調節免疫、降血糖、抗腫瘤、降血脂、抗氧化等多種生物活性。因此,本文以魷魚的加工副產物纏卵腺為原料,通過單因素結合響應面分析方法研究優化糖蛋白的最佳提取工藝,為魷魚加工副產物的高附加值利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魷魚纏卵腺(秋季產) 福建省閩南水產有限公司提供,除去外層薄膜后分裝,凍藏于-18℃;NaOH、NaBH4、無水乙醇、NaCl、苯酚、濃硫酸、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、無水碳酸鈉等 國產分析純。

5804R離心機 德國艾本德(eppendorf)公司;LET132膠體磨 深圳市雷通實業有限公司;752型紫外可見光分光光度計 上海光譜儀器有限公司;大盤面磁力攪拌器 德國IKA實驗室技術公司;XW-80A旋渦混合器 上海康華生化儀器制造有限公司;LGJ-12冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;2ZX-2型旋片式真空泵 浙江黃巖寧溪醫療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 測定方法 采用苯酚-硫酸法測定糖蛋白中的總糖含量[7];Folin-酚法測定糖蛋白中的蛋白含量[8];硫酸鋇比濁法測定糖蛋白中硫酸基的含量[9]。

1.2.2 魷魚纏卵腺糖蛋白提取工藝流程 取100g預處理的魷魚纏卵腺,去膜后勻漿。在有一定料液比的勻漿液中添加不同濃度NaOH和NaBH4的混合液,混勻,并在不同的溫度、時間條件下間隔攪拌提取,8000r/min離心10min,取上清液,經不同的醇沉倍數沉淀并透析,凍干得糖蛋白。

1.2.3 魷魚纏卵腺糖蛋白提取工藝參數單因素實驗 在保持其它因素相同條件下,分別考察不同的NaOH濃度、NaBH4濃度、液料比、提取時間、提取溫度、醇沉倍數等各因素對魷魚纏卵腺糖蛋白得率、總糖、蛋白質和溶解度的影響。重復進行3次平行實驗,取平均值進行統計分析。

1.2.3.1 NaOH濃度的選擇 液料比30∶1,NaBH4濃度0.1mol/L,加入0.05、0.1、0.4、0.7、1.0、1.5mol/L濃度的NaOH,4℃提取4h,8000r/min離心10min,取上清,加入1倍無水乙醇醇沉,取沉淀透析,凍干,測定纏卵腺糖蛋白的得率。

1.2.3.2 NaBH4濃度的選擇 液料比30∶1,NaOH濃度0.4mol/L,加入0、0.1、0.2、0.3、0.4mol/L濃度的NaBH4,4℃提取4h,8000r/min離心10min,取上清,加入1倍無水乙醇醇沉,取沉淀透析,凍干,測定纏卵腺糖蛋白的得率。

1.2.3.3 液料比的選擇 NaOH濃度0.4mol/L,NaBH4濃度0.1mol/L,分別加入10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1的提取緩沖液,4℃提取4h,8000r/min離心10min,取上清,加入1倍無水乙醇醇沉,取沉淀透析,凍干,測定纏卵腺糖蛋白的得率。

1.2.3.4 提取時間的選擇 液料比30∶1,NaOH濃度0.4mol/L,NaBH4濃度0.1mol/L,4℃條件下分別提取0.5、1、2、3、4、5h,8000r/min離心10min,取上清,加入1倍無水乙醇醇沉,取沉淀透析,凍干,測定纏卵腺糖蛋白的得率。

1.2.3.5 提取溫度的選擇 液料比30∶1,NaOH濃度0.4mol/L,NaBH4濃度0.1mol/L,分別在4、15、25、35、45℃下提取時間4h,8000r/min離心10min,取上清,加入1倍無水乙醇醇沉,取沉淀透析,凍干,測定纏卵腺糖蛋白的得率。

1.2.3.6 醇沉倍數的選擇 液料比30∶1,NaOH濃度0.4mol/L,NaBH4濃度0.1mol/L,4℃提取4h,8000r/min離心10min,取上清。分別加入0.8、1、2、3、4倍的無水乙醇醇沉,取沉淀透析,凍干,測定纏卵腺糖蛋白的得率。

1.2.4 提取工藝響應面優化實驗 根據單因素實驗,設計以提取時間(A)、提取溫度(B)和NaOH濃度(C)3個主要因素為自變量進行組合優化,提取率(Y)為響應值,采用Box-Benhnken中心組合模型進行響應面分析,共15個實驗點。實驗設計安排如表1。

表1 Box-Benhnken實驗因素水平表Table 1 Box-Benhnken test factor-levels Table

2 結果與分析

2.1 NaOH濃度對提取率的影響

從圖1可以看出,在一定范圍內,隨著NaOH濃度的增加,魷魚纏卵腺糖蛋白的提取率呈先升高后下降的趨勢,提取率在NaOH濃度0.4mol/L時達最高,為11.9%。當NaOH濃度較低時,糖蛋白富集程度較低,提取率也就較低;NaOH濃度過高時,高濃度堿會使糖鏈斷裂而破壞糖蛋白的結構[10],從而導致提取率的降低。因而選擇NaOH濃度為0.4mol/L作為響應面優化的參數。

圖1 NaOH濃度對糖蛋白提取率的影響 Fig.1 Effect of NaOH concentration on extraction ratio of glycoprotein

2.2 NaBH4濃度對提取率的影響

NaBH4具有還原性,可以防止糖鏈發生過度β-消除反應,減少糖鏈的斷裂,從而達到保護糖鏈的目的,且其強還原性可將羰基、醛基還原為羥基[11]。NaBH4濃度對魷魚纏卵腺糖蛋白提取率的影響如圖2所示,提取率隨著NaBH4濃度的增加呈上升的趨勢,但是在實驗過程中,提取的魷魚纏卵腺糖蛋白的溶解度卻隨著NaBH4濃度的升高而逐漸減小,當NaBH4濃度達到0.4mol/L時,溶解性很差。因此,綜合考慮溶解度和提取率,確定NaBH4濃度為0.1mol/L。

圖2 NaBH4濃度對糖蛋白提取率的影響 Fig.2 Effect of NaBH4 concentration on extraction ratio of glycoprotein

2.3 液料比對提取率的影響

液料比對魷魚纏卵腺糖蛋白提取率的影響如圖3所示。從圖3中可以看出,當液料比10∶1時提取率較低,隨著液料比增加到20∶1時,提取率大大升高,之后略有降低,但無明顯變化。由于液料比較低時,提取液中的NaOH的含量相對偏低,使得糖蛋白無法充分富集,在醇沉時也相對不易收集,導致提取率較低。同時,低液料比處理組在造成提取率較低的現象。液料比低于30∶1,勻漿時很粘稠,離心難以質液分離,不好操作,綜合實驗操作難易情況選取30∶1作為提取的液料比。

圖3 液料比對糖蛋白提取率的影響 Fig.3 Effect of ratio of water/material on extraction ratio of glycoprotein

2.4 提取時間對提取率的影響

從圖4可以看出,隨著提取時間的延長,糖蛋白的提取率也隨著增加,當提取3h時提取率達最高,之后變化不明顯。可能是因為β-消除米氏加成反應在較短的時間內無法充分進行,從而影響糖蛋白的富集;當達到一定時間后,反應已充分完成,提取率就趨于平衡。因此,確定糖蛋白的提取時間為3h。

圖4 提取時間對糖蛋白提取率的影響 Fig.4 Effect of extraction time on extraction ratio of glycoprotein

2.5 提取溫度對提取率的影響

提取溫度對魷魚纏卵腺糖蛋白提取率的影響如圖5所示,隨著溫度的升高,提取率逐漸下降,因為較高的溫度會加劇β-消除米氏加成反應的發生,從而造成糖鏈的斷裂,小分子糖蛋白在50%的乙醇中難以沉淀,提取率降低;并且溶解度隨溫度的升高而增大。因此綜合考慮經濟成本及溶解度因素,確定在室溫25℃下進行魷魚纏卵腺糖蛋白的提取。

圖5 提取溫度對糖蛋白提取率的影響 Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction ration of glycoprotein

2.6 醇沉倍數對魷魚纏卵腺糖蛋白提取率的影響

采用無水乙醇沉淀物質時,當乙醇濃度為50%～60%時,可用來沉淀粘液質、淀粉等大分子物質,濃度達到75%可沉淀蛋白質等,當達到80%以上時,基本可以沉淀所有的蛋白質、多糖和無機鹽等[12]。從圖6中可以看出,隨著乙醇添加量的增加,提取率逐漸升高,當添加量超過1倍后,提取率增加緩慢。當添加0.8倍乙醇時,沉淀效果較差,不易收集;當乙醇添加量增加至1倍時,醇沉效果好且不需離心即可撈起沉淀進行收集;當乙醇添加量繼續增加時,提取物可能有無機鹽、蛋白質、多糖等雜質。因此,選擇乙醇添加量為底物體積的1倍。

2.7 響應面法優化魷魚纏卵腺糖蛋白的提取工藝

2.7.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗 在單因素實驗的基礎上,綜合考慮溶解性及操作方便性,選取主要影響因素提取時間(A)、提取溫度(B)和NaOH濃度(C)為響應因子,利用Design-Expert 8.0.6中的Box-Benhnken中心組合設計法設計響應面,實驗設計與結果如表2所示。

表3 回歸模型的方差分析結果Table 3 Variance analysis of the regression model

圖6 不同醇沉倍數的糖蛋白得率 Fig.6 Effect of ethanol adding volume on extraction ratio of glycoprotein

根據響應面統計方法對實驗數據進行擬合,得到關于提取時間、提取溫度和NaOH濃度的編碼方程式:Y=12.47+0.078A-0.20B-0.66C-7.500E-3AB+2.500E-3AC+0.13BC-0.096A2+0.13B2-3.72C2。由編碼方程一次項回歸系數的絕對值大小可以得到各響應因子對響應值的影響程度依次為:NaOH濃度(C)>提取溫度(B)>提取時間(A)。

建立響應值對自變量編碼值的二次回歸實際模型方程為:Y=12.43324+0.69417A-0.38408B+28.37546C-1.50000E-3AB+8.33333E-3AC+0.083333BC-0.095833A2+5.26667E-3B2-41.37037C2。為檢驗方程的有效性,利用分析軟件進一步對其進行方差分析,結果見表3和表4。

由表3二次回歸模型的方差分析結果可見,該模型顯著性檢驗p<0.0001,有統計學意義,能很好地解釋數據的差異性。3個自變量中B和C對魷魚纏卵腺糖蛋白的提取率影響顯著(p<0.05),C2對魷魚纏卵腺糖蛋白提取率的影響極顯著(p<0.01),A2、B2和各因素交互作用對提取率的影響均不顯著(p>0.05)。

該模型失擬項顯著性水平p=0.2363不顯著(p>0.05),說明回歸方程對實驗點的擬合度較好。從表4可信度分析結果可以看出,模型預測R2(Pred R-Square)=0.9445,表明該模型可以較好地預測新觀測值的好壞;R2(R-Square)=0.9960,表明該模型對實驗點的適配度達到99.6%,具有較高的擬合度;修正R2(Adj R-Square)=0.9887,表明該模型能解釋98.87%實驗數據的變異性。同時R2(R-Square)與修正R2(Adj R-Square)接近,更說明該模型擬合程度好,具有可靠性,適合對魷魚纏卵腺糖蛋白提取工藝進行分析和預測。

表2 響應面實驗方案與實驗結果Table 2 Schedule of response surface methodology and corresponding experimental results

表4 回歸模型的可信度分析Table 4 The credibility analysis of the regression model

2.7.2 響應面分析 圖7反映的是響應函數與變量間的影響效應。在一定的因素水平范圍內,魷魚纏卵腺糖蛋白的提取率隨著NaOH濃度和時間水平的增大而增加,但隨著因素水平的進一步增大,提取率反而降低。然而,提取率隨著溫度的升高反而降低。高溫加劇了β-消除米氏加成反應,可能破壞糖鏈和使蛋白變性,從而影響提取率。

圖7 各因素交互作用的響應面圖 Fig.7 Responsive surface of interaction between factors

運用回歸模型優化的魷魚纏卵腺糖蛋白的最佳提取工藝為:提取時間3.44h,提取溫度25℃,NaOH濃度0.37mol/L,預測魷魚纏卵腺糖蛋白提取率為12.85%。

2.7.3 驗證實驗 為了實驗方便將響應面法優化的實驗條件修改為:提取時間3.5h,提取溫度25℃,NaOH濃度0.37mol/L。該條件下重復3次,提取率分別為12.75%、12.80%、12.81%,平均12.79%,相對誤差為0.47%,說明通過響應面優化得到的最佳工藝參數有效、可靠,能較好地模擬魷魚纏卵腺糖蛋白提取工藝,預測提取率。

2.8 魷魚纏卵腺糖蛋白基本成分測定

根據響應面優化法修正的最優提取工藝提取魷魚纏卵腺糖蛋白,經凍干后測定其基本成分,結果見表5。從表5可以看出所提取的糖蛋白中糖含量為72.5%,超過50%的糖鏈,占糖蛋白組成的絕大部分,是一種高分子糖蛋白分[13]。另外,該糖蛋白中還含有3.0%的硫酸根,說明魷魚纏卵腺糖蛋白可能是一種在非還原末端發生了硫酸化的粘蛋白。

表5 魷魚纏卵腺糖蛋白提取物基本成分分析Table 5 Composition analysis of the extraction of glycoprotein from squid

3 結論

通過對魷魚纏卵腺糖蛋白提取過程中可能對實驗結果產生影響的NaOH濃度、NaBH4濃度、液料比、提取時間、提取溫度和醇沉倍數等6個因素進行單因素實驗,確定影響魷魚纏卵腺糖蛋白提取的最主要因素為NaOH濃度、提取時間和提取溫度;以3種因素為響應因子,應用響應面法優化魷魚纏卵腺糖蛋白提取的最佳工藝條件,結果表明,最佳提取工藝條件為提取時間3.5h,提取溫度25℃,NaOH濃度0.37mol/L,在該條件下的提取率為12.79%,與實驗預測結果相符。在優化的最佳提取工藝條件下獲得的魷魚纏卵腺糖蛋白的糖含量72.5%,蛋白含量22.7%,硫酸根含量3.0%,是一種硫酸化的粘蛋白。

[1]楊芳，吳永沛，陳梅香，等.阿根廷魷魚肌原纖維蛋白及肌肉組織凝膠保水性研究[J].水產科學，2008，27(8)：386-389.

[2]林彩平，吳成業.酶解法提取魷魚肝油的生產工藝研究[J].福建水產，2013，35(1)：32-39.

[3]宋茹，祝穎，俞群娣. 酶解法制備的魷魚墨黑色素鑒定及理化性質[J].浙江海洋學院學報：自然科學版，2009(1):23-26.

[4]章建設，雷曉凌.魷魚內臟糖蛋白提取工藝及其免疫活性初步研究[J].現代食品科技，2008，24(2)：167-169.

[5]王津偉，王春琳，余紅衛.曼氏無針烏賊纏卵腺組織學及超微結構的研究[J].水產科學，2010，29(2)：87-89.

[6]Yu A,Shigeru K. Development and application of marine mucin for cosmetics[J]. Fragrance,2006,34(3):14-20.

[7]姜波，王艷穎，劉長建，等.銀杏葉多糖提取、純化及含量的測定[J].時珍國醫國藥,2007,18(11):2729-2731.

[8]大連輕工業學院.食品分析[M].北京:中國輕工業出版社,1998,75-79.

[9]張亞男.硫酸鋇比濁法測定皂角多糖修飾物中的硫酸基的研究[J].泰山學院學報,2011,33(3):67-71.

[10]焦慶才.糖工程概論[M].北京:科學出版社,2010:45.

[11]Shigeru Kimura,Yoko Sugiura,Haruo Mizuno,etal. Occurrence of a Mucin-type Glycoprotein in Nidamental Gland Mucosubstance from the Squid Illes argentinus[J].Fisheries Science,1994,60(2):193-197.

[12]王慶.淺談中藥的醇沉工藝及設備[J].裝備應用與研究,2009(32):38-40.

[13]高橋宏明.粘蛋白[J].日本醫學介紹，2005,26(2):57-58.