γ-氨基丁酸的制備方法 與含量測定研究進展

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(1.昆明理工大學生命科學與技術學院,云南昆明 650500;2.昆明理工大學云南道地藥材研究開發中心,云南昆明 650500)

γ-氨基丁酸(簡稱GABA),是一種四碳非蛋白氨基酸,廣泛存在于動植物中。據文獻記載,早在1949年就從土豆中發現了GABA,1950年又在動物大腦中發現GABA,而在1983年則首次用化學合成的方法制備了GABA[1-5]。在神經中樞中,1/3的神經突觸部位都是以GABA為遞質,與大腦皮質、垂體、下丘腦、生殖器官、肝臟和腎臟等存在著密切的關系,它于人體存在諸多益處,如對心肺血管有直接或間接作用,調節血壓與心率;營養神經系統的發育,促進膜蛋白的合成;廣泛應用于癲癇、帕金森、亨廷頓氏病等疾病的治療;促進細胞新陳代謝,提高腦活力;抑制谷氨酸脫羧反應,降低血氨,保護肝臟;降低神經元活性,鎮靜神經,抑制焦慮等癥;還具有保護腎臟、抗衰老、促進生長激素分泌、預防肥胖、促進酒精代謝等功效[1,6-11]。近年來,GABA的相關研究變得越來越熱門,2009年衛生部批準其為新資源食品,它將會成為21世紀新資源食品的生產原料之一[12-13]。因此,GABA的制備純化、檢測方法與綜合開發利用等相關研究已被人們普遍關注,大量的制備方法和檢測技術應用于此類研究中,且仍在不斷的改進中。其中一些新技術具有相當的發展潛力和推廣價值,本文針對近年來GABA的制備方法和含量檢測技術進行了綜述。

1 制備方法

GABA的別名為氨酪酸或哌啶酸,化學名為4-氨基丁酸,其結構如圖1所示,分子式為NH2CH2CH2CH2COOH,分子量為103.1。易溶于水,微溶于熱乙醇溶液,不溶于乙醚等有機試劑。熔點為202℃,在高于熔點溫度的情況下,分解為水和吡咯烷酮。目前,GABA的制備方法主要有化學合成法、微生物發酵法、植物富集法等。

圖1 γ-氨基丁酸(GABA)化學結構 Fig.1 The chemical structure of γ-aminobutyric acid(GABA)

1.1 化學合成法

表1 GABA化學合成制備方法Table 1 Chemical synthesis methods of GABA

化學合成法成本高產率低,在生產過程中涉及到危險有毒溶劑,而且存在化學成分殘留,因此使用范圍存在局限性,不能用于食品、藥品等方面。目前,化學制備方法主要包含8種化學反應(見表1)。

1.2 微生物發酵法

微生物發酵法是利用生物發酵技術,通過篩選優良、高產、穩定的菌種,發酵生產GABA,該方法對生產設備要求高,且對環境要求比較嚴格,產品純度不高,但是可以用作天然食品藥品添加劑,對生物體傷害遠比化學合成法低。它在食品等工業領域中應用廣泛、歷史悠久,最早利用大腸桿菌脫羧酶生產GABA,但是因其存在安全隱患,無法應用于食品、藥品生產中[14]。隨著綠色食品的不斷開發,后被乳酸菌、酵母菌、曲霉菌等微生物所取代,催化谷氨酸脫羧,制備GABA,具有成本低、產量高、安全等優點,且已逐步走入產業化生產階段,其中乳酸菌是一種食品安全級(GRAS)的微生物,因其具有安全、高效等諸多優點,被譽為重要的益生菌,具有很大的潛在價值。乳酸菌的來源豐富,可以從韓國泡菜、酒糟、乳酪發酵劑、發酵黃漿水中分離獲得[14，20-21]。Noriko Komatsuzaki等人在2005年對Lb.paracasei NFRI 7415進行研究,最終能積累產生30g/L的GABA[22]。吳非等人改良以保加利亞乳桿菌L2為菌種生產GABA的方法,比之前產量分別提高了25.63%和30.77%[23]。許建軍等人通過研究生物發酵生產,以乳酸菌和酵母菌混合物作為菌種,以L-谷氨酸鈉為轉化底物制備GABA,濃度高達300～500mg/100mL[24]。黃俊等人從未滅菌的生牛奶中篩選出高產GABA的乳酸菌Lactobacillus brevis CGMCC-1306,所得GABA的含量高達76.36g/L[14]。

1.3 植物富集法

植物富集法是用現有的提取技術,對含有GABA的植物進行分離純化,成本低,產品純度較高,相對于微生物發酵方法,它對生產環境要求較低,又比化學合成法安全。目前從植物中制備GABA常用的方法主要可以分為溶劑萃取法、柱分離制備法等。

1.3.1 溶劑萃取法 一種是選取水/醇為提取劑,利用GABA在植物和水/醇中溶解度或分配系數的不同能使GABA從植物內轉移到水/醇中的原理,經過反復萃取,可將絕大部分的GABA提取出來。在提取過程中可分為靜置提取和超聲提取,通常超聲提取的產率比靜置提取產率高。其中固液比一般在1∶1～1∶30,提取溫度為40～70℃,提取時間為靜置2～5h或者超聲20～90min,提取1～3次,過濾留濾液,分離純化,經茚三酮溶液定性檢測或經其他儀器定量檢測,濃縮干燥即得[25-28]。沈強等人采用水提法,超聲提取茶葉中GABA[25]。黃美娥等人以南瓜為原料,選取20%乙醇為溶劑,料液比為1∶17(w/v),提取1h,得到的產率為209mg/100g[28]。水/醇提取法為最常用的溶劑提取方法,所得GABA純度較高,但操作過程較為繁瑣。其中醇提法提取GABA含量低于水提法,提取成本高于水提法,不過因醇溶劑具有易揮發等優點,也被人們廣泛使用。

另一種是選取鹽溶液等溶劑提取GABA,如磺基水楊酸、檸檬酸緩沖鹽、碳酸鈉-碳酸氫鈉等。錢愛萍等人選取5%磺基水楊酸,在適宜的條件下提取過濾,所得GABA含量高達98.48%,比鹽酸水解法提高13.54%～13.77%,比醇提法提高7.42%～8.06%,且方法穩定簡單[29]。而廖周華等人使用的檸檬酸緩沖鹽為介質,從麥麩中提取GABA[30]。李炳坤等人從桑葉中提取GABA,則選用2.4mmol/L碳酸鈉-2.4mmol/L碳酸氫鈉作為介質[31]。此法處理簡單、快速,且在使用離子色譜檢測時,能消除水提法中水所帶來影響實驗精準度的負峰。但是使用碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液時,溫度不宜過高,因為碳酸氫鈉受熱易分解。

1.3.2 柱分離制備法 柱分離制備法也稱為柱色譜法,根據樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配系數不同,進行梯度洗脫,從而分離的一種層析法,一般選用樹脂、硅膠、活性炭等柱填充材料進行分離。嵇豪等人用D101樹脂柱對紅曲發酵液進行分離洗脫,最終GABA的總得率為45.4%[32]。活性炭吸附法是一種特殊柱分離制備方法。活性炭是一種多孔性的含炭非極性分子物質,易于吸附非極性或極性很低的吸附質,具有高度發達的孔隙構造,增大了與物質充分接觸的表面積,產生極強的吸附作用。在甘蔗梢中提取氨基酸時就采用活性炭吸附法,在50～90℃的情況下動態吸附,然后用0.5～2.0mol/L氨水和30%～90%乙醇動態洗脫[33]。該方法能讓原材料體現物盡其用的含義,節約了操作時間,而且降低有害物質的產生,對操作環境也有所降低。

1.3.3 鹽酸水解法 鹽酸水解法[34-35]是檢測氨基酸的常規方法即國標法,在GB/T5009.124-2003、GB/T 18246-2000等國標中均有涉及,具有廣泛認可性。其基本原理是植物中的蛋白質經鹽酸水解為游離的氨基酸,經離子交換柱分離,茚三酮溶液定性檢測,再通過分光光度計比色確定其GABA含量,其最低檢出限為10pmol,但是存在局限性,不適用于檢測蛋白質含量低的植物。

1.3.4 膜分離技術 膜分離技術是利用選擇性透過膜,借助于外界能量或化學位差的推動,由于膜兩側推動力不同,液體中物質選擇性的透過,以達到進行分離純化的目的。馮骉等人在早前建立了間歇稀釋過濾和連續稀釋過濾兩種的數學模型,回收率高達95%[36]。分離GABA通常采用超濾與納濾相結合的方法獲得濃度和純度都較高的GABA,但是該方法具有分離膜易受污染、膜種類少、易產生濃度極化現象等缺點[37]。

2 含量測定方法

GABA在常溫下為小葉狀或針狀白色結晶,微臭,易潮解,在干燥條件下穩定性強。但是GABA無紫外吸收,在建立檢測方法時,存在一定局限性,諸多方法均需經過衍生過程才能檢測。目前,測定GABA含量的方法有比色法、電泳法、色譜法、氨基酸分析儀等。

2.1 比色法

此法利用紫外可見分光光度計法測定待測物含量,其原理是根據各物質對不同波長處的輻射吸收程度不同而測量。最通用的方法當屬茚三酮反應,即在加熱條件及弱酸環境下,加入適量2%茚三酮溶液,氨基酸可與2,2-二羥基-1,3-茚三酮反應生成有色化合物,是一種可定量的顯色反應。所呈現的顏色一般為紫藍色,但是隨反應的條件不同而不同(酸度、溫度、離子等)[38]。而陳恩成等人基于Berthelot顯色反應,研究出使用紫外可見分光光度計快速測定GABA含量的比色法,以重蒸苯酚和次氯酸鈉溶液作為顯色劑顯色反應,在645nm處測定其含量[39]。該方法操作簡單、檢測速度快、重現性好,適合于測定多種植物中GABA的含量,但對操作過程要求高,且不能存在氨及銨鹽,避免干擾。

2.2 放射性免疫法

1959年,Yalow和Berson創建了放射性免疫法,它是一種超微量測定的體外放射分析技術。之后被用于GABA的含量檢測中,綜合了放射性元素的靈敏性和免疫反應的特異性,利用同位素標記的與未標記的抗原,與GABA偶聯結合,經放射確定其含量[40]。此法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便,但是受藥盒時間限制,存在局限性。

2.3 紙上電泳法

紙上電泳法是以紙為基板,在外加電場的作用下,待測物從一側定向移動到另一側,由于物質大小差異導致移動速度存在差異,從而達到分離的作用。湯茶琴等人利用此法對茶葉中GABA含量進行檢測,能較好分離且斑點清晰,與氨基酸自動分析儀法的測試結果相比較,兩者間無明顯差異。它有高效、可回收、靈敏度高、低成本等優點,但是耗電、操作繁瑣、需控制溫度pH等多因素影響[41]。

2.4 酶聯熒光法

此法又稱ELISA法,用于GABA定量測定,根據抗原與抗體的特異反應,與酶連接的待測物與底物產生顏色反應。胡紅焱與楊樹德利用GABA酶偶聯細菌熒光酶生物發光系統建立GABA的定量檢測法,具有靈敏度高、特異性強的特點,線性范圍大,精密度低[41-42]。

2.5 色譜法

2.5.1 紙層析法 紙層析法,是一種以紙為載體的色譜法,依據極性相似相溶的原理,以紙纖維上吸附的水分或其他緩沖鹽等作為固定相,以不與水相溶的有機溶劑作為流動相。用一定比例的展開劑從點樣的一段進行展開,由于待測樣中各物質分配系數不同,擴散速度不同,從而達到分離的目的。Wang Q X等人對天然產物進行檢測,最終確定展開劑最佳比例為正丁醇∶冰醋酸∶水=5∶3∶2,顯色劑為0.4%茚三酮溶液,以GABA標準溶液作為對照品[43]。此法操作簡便、成本較小,但是精準度不高,只能用于定性檢測,不如高效液相色譜法應用普遍。

2.5.2 薄層色譜法 薄層色譜法是一種氨基酸定性快速檢測的方法,能夠辨別氨基酸種類,其原理與紙層析法相同,均是依據相似相容的原理。對于薄層色譜測定方法,楊四潤等人建立了薄層色譜檢測方法對茶葉中GABA含量進行檢測,認為正丁醇∶冰醋酸∶水比例為4∶2∶1的展開劑分離效果較好,能達到最低檢測限為0.03mg/mL[44]。此法易于操作、快速、低成本,但是無法準確計算待測物含量,故只能用于定性分析。

隨著科技發展,在薄層色譜法的基礎上結合薄層掃描儀建立了一種定量方法——薄層掃描法(簡稱TLCS),又名原位定量薄層色譜。黃美娥等人就采用反射雙波長(λs=515nm;λr=680nm)線式掃描對南瓜中GABA含量進行定量分析[28]。該方法快速、簡便、準確,精密度高,重復性好,在0.125～2.0mg/mL間線性關系良好,可用于GABA的痕量檢測。

2.5.3 高效液相色譜法(HPLC) 高效液相色譜法是以不同極性(甲醇、乙腈、水、醋酸鈉緩沖鹽等)且按一定比例混合的溶液為流動相,高壓輸送流經裝有固定相的色譜柱,進行梯度洗脫,各成分極性不同,因而洗脫時間不同,從而被分離開,在254～360nm紫外檢測波長下進行檢測分析。進樣量為μL數量級,具有高速、高效、高靈敏度、準確性好等特點,應用廣泛。因GABA無紫外吸收且酸性極強,需經過柱前衍生過程才能檢測,所用的衍生化試劑主要有鄰苯二甲醛(OPA)、異硫氰酸苯酯(PITC)、2,4-二硝基氟苯(FDNB)、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯(AQC)。其中OPA衍生法步驟簡單、反應快速、過量試劑不干擾結果,但是衍生物不穩定,不易放置太久;PITC衍生法所得衍生物穩定,但需在無水條件下進行,容易影響分析柱使用壽命;FDNB衍生法能得到較為穩定的衍生物,但是反應副產物會干擾檢測結果;AQC衍生法制取穩定的衍生物且副產物不影響結果。Clark G等人選用OPA作為衍生化試劑,在338nm下檢測含量[45]。孫蓮等人則選用的衍生化試劑為PITC,在254nm下檢測桑葉中GABA含量[46]。而且PITC衍生法早在1996年就已得到國內業界認可,被列入氨基酸分析方法通則[47]。

2.5.4 GC-MS法 GC-MS法又稱氣相-質譜聯用檢測法,當待測物進入氣相,被氣化吸附在固定相上,因為吸附能力不同,所以出峰時間不同,樣品在進入質譜之后在離子源中電離,生成不同荷質比的帶正電荷的離子,經加速電場的作用,形成離子束,進入質量分析器。此法分離效果好,靈敏度高,檢測限寬,適合于揮發性物質痕量分析,但是檢測儀器價格昂貴,操作較為復雜。因為GABA揮發性小,所以需要衍生化才能進行檢測,衍生化試劑較常見的有硅烷化試劑、烷基氯甲酸酯類試劑等,衍生化反應時間短,但衍生過程復雜,不易操作。其中硅烷化試劑在GC-MS分析中應用最廣,反應性強,衍生物揮發性好,但遇水或酸不穩定,易污染FID檢測器,最常見的是MTBSTFA(N-(特丁基二甲基硅烷)-N-甲基三氟乙酰胺)、MSTFA(N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺)、BSTFA(雙(三甲基硅烷)三氟乙酰胺)等;而烷基氯甲酸酯類試劑的衍生反應產率高,速度極快,但其過量試劑及副產物可干擾結果,必須除去。Paul L Wood和Damien Richard等人均選取了MTBSTFA作為衍生化試劑[48-49]。

2.6 氨基酸分析儀法

氨基酸自動分析儀測定氨基酸是國標采用的方法之一[34],得到業界廣泛認可。其測定原理是因待測樣品中含有的各種氨基酸的結構、酸堿性、極性及分子大小均有差異,利用陽離子交換柱將它們分離,經緩沖液梯度洗脫,茚三酮進行顯色反應,測定其含量。任紅波使用日立835-30型氨基酸分析儀,僅用20min就測定糙米中的GABA[50]。分析儀靈敏度高,最小檢出限可達1pmol,重現性好且高效,被廣泛普及到氨基酸的檢測中,無需前期處理,可用于大批量檢測。

2.7 毛細管電泳-電化學檢測法

孔令瑤等人采用毛細管電泳-電化學檢測(CE-ED)的方法對發芽黑米胚芽中GABA含量進行檢測,選取鄰苯二甲醛(OPA)為柱前衍生化試劑[51]。該方法檢測時間短、靈敏度高、重現性好,但是操作過程復雜,就目前而言CE-ED法在檢測GABA含量中使用較少。

綜上所述,雖然已有很多制備與檢測方法,但對于藥食同源的GABA來說,又要區分開藥品與食品的定義,在食品中添加GABA,不能像藥品一樣進行簡單添加,更多地考慮其安全、環保等因素,從源頭開始控制,從天然物質中獲取,生產出食品級GABA,目前,其制備方法漸漸由化學合成法轉向從自然界中獲取,其中微生物發酵法較為成熟,得率較高,已經形成產業化[14]。就中國而言,植物資源非常豐富,而已開發的資源較為局限,現今植物原料中GABA含量低,提取成本較高且純化難度高,多數原料不適宜產業化發展,可見植物富集法具有很大的潛在發展前景。日本和臺灣均已將GABA列為食品級,而我國也于2009年將GABA列為新資源食品,這對GABA的檢測方法拋出了又一嶄新的問題。產品的標準化、市場的規范化都需要快速、準確、簡便的檢測方法作為支撐。現今這些檢測手段仍需優化,大量檢測方法操作過程復雜且耗時長,檢測儀器昂貴無法普及。

3 展望

隨著人們步入屬于生命科學時代的21世紀,越來越多的人開始關注自己的健康,越來越多的目光開始投向天然綠色食品這一方向。因GABA具有降低血壓、解除抑郁、增強腦功能、強肝健腎等諸多藥理活性[1,6-11],關于GABA的保健功能、來源與提取等方面的研究引起國內外高度重視,對GABA的開發利用成為新的研究熱點。在日本,特別是在成功開發出富含GABA的發芽糙米后,富含GABA的相關產品就被大力開發,并且深受廣大消費者青睞,現已形成產業化生產,而且如今的GABA已經廣泛地應用于飲品、食品、調味料、保健品、藥品等制品中,開發出適用于不同人群的食品,具有廣闊的市場前景。

面臨GABA的食品化,上述這些問題已經引起了業界的廣泛關注,隨著科學技術的進步,分離提取和檢測方法不斷豐富,但其制備工藝有待于進一步向提取出安全食品級GABA方面完善,從更廣闊的大自然中攝取天然的GABA。拓展GABA的來源渠道,尋找高含量的物種,降低提取成本已成為有待解決的關鍵問題。隨著綠色時代的到來,大量的提取檢測方法將會繼續優化,但GABA的檢測工作仍是科研工作者要攻克的技術問題。尋求快速準確檢測GABA含量的方法會推動我國這一新資源的快速發展,同時也可以避免造假、低質的產品流入市場,使市場規范化。高純度的GABA提取工藝技術還不夠成熟,且成本較高,不適合產業發展,食品級GABA提取技術在國內仍有待完善。

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