唾液酸的生理功能、應用及其生產方法

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(1.大連工業大學生物工程學院,遼寧大連 116034;2.中國科學院上海高等研究院可持續技術研究中心,上海 201210)

1957年,Blix等[1]用弱酸水解方法,從唾液腺粘蛋白中分離出了與Bia’s試劑反應呈紫色的物質,因而命名為唾液酸(Sialic Acid,SA)。1960年唾液酸的化學結構被研究者們精確的解析出來[2]。唾液酸是一類含有9個碳原子并具有吡喃糖結構的酸性氨基糖的總稱,系統命名為5-氨基-3,5-二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。唾液酸廣泛的分布于自然界中,已經發現很多生物體內都有唾液酸的存在,目前發現的唾液酸已有50余種,大多數都是5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(Neu5Ac)和2-酮基-3-脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(KDN)的衍生物(圖1[3])。N-乙酰-D-神經氨酸(Neu5Ac或NeuAc)是唾液酸的主要種類,它的含量占整個唾液酸家族的99%以上,所以通常所說的唾液酸多是指Neu5Ac,通常以α-糖苷的形式位于非還原性寡聚糖如糖蛋白和糖脂的末端。

圖1 唾液酸的核心結構 Fig.1 The core structure of sialic acids

流感是一種高感染性疾病,可感染鳥類和哺乳動物。二十世紀爆發三次世界性流感(1918,1957和1968年)奪去了數百萬人的性命。N-乙酰神經氨酸是抗流感病毒藥物扎那米韋的前體,1999年,該藥物被美國FDA批準用于治療A-型和B-型流感[4]。2006年,世界衛生組織(WHO)已多次警告說,禽流感可能是二十一世紀面臨的最大威脅,因此唾液酸酶抑制劑類抗流感藥物的開發十分緊迫[5]。母乳喂養被認為是促進嬰兒大腦發育的最好途徑,能夠促進大腦神經突觸的發育,母乳中唾液酸含量比普通奶粉高得多,因此,許多公司開發了含唾液酸的嬰幼兒奶粉,使其接近母乳水平[6]。Saifer等[7]曾報道某些晚期癌癥患者血清中唾液酸含量比正常人高。唾液酸水平在癌癥診斷中具有一定的價值。傳統的唾液酸的生產方法主要包括天然原料提取法、化學合成法、多聚物分解法、酶及固定化酶法和全細胞生物催化法等,這些方法都存在各自的弊端。它們有著天然原料中唾液酸含量低、后期分離純化困難、所需合成原料價格昂貴和不環保等缺點,因此需要探索新的能夠實現產業化的方法用于唾液酸的生產。微生物發酵法由于克服了上述缺點而成為近些年來發現的最為理想的用于生產唾液酸的方法。唾液酸由于其眾多的生理功能和應用的廣泛性已經受到了人們越來越多的關注,本文則對唾液酸的生理功能、應用和生產方法進行了綜述,并對其未來發展方向進行了展望,以有助于唾液酸的理論研究和產業發展。

1 唾液酸的生理功能

唾液酸具有提高嬰兒智力和記憶力[8]、抗老年癡呆[8]、抗識別[8]、提高腸道對維生素及礦物質的吸收[6]、抗菌排毒和抗病毒[8]等作用。

1.1 提高嬰兒智力和記憶力

唾液酸是大腦神經節苷脂的重要組成成分,神經細胞膜的唾液酸含量是其他細胞的20倍,由于大腦信息傳遞及神經沖動的傳導必須通過突觸來實現,而唾液酸是作用于大腦細胞膜和突觸的腦部營養素,所以唾液酸能夠促進記憶力和智力的發育。Bing Wang等[9]研究發現,增加哺乳動物乳豬飲食中的唾液酸含量,其腦中的唾液酸含量增加,與學習相關的基因的表達水平增加,從而增強學習及記憶能力。在嬰兒體內,唾液酸的含量只有母乳中含量的25%。由于唾液酸是在肝臟中合成的,在兒童發育早期,大腦發育很快而肝臟發育很慢,由肝臟合成的唾液酸很難滿足大腦發育的需要。因此,嬰兒期特別需要補充唾液酸。

1.2 抗老年癡呆

唾液酸在人腦中含量很高,這與神經細胞生長有關。細胞表面的唾液酸使細胞和大分子免受酶和免疫系統的攻擊,這是內在免疫的體現。但老年癡呆和精神分裂癥等神經性疾病患者腦中或血液中的唾液酸含量下降,經藥物治療后,其唾液酸含量恢復正常,從而表明,唾液酸參與神經活動[10]。

1.3 抗識別、提高腸道對維生素及礦物質的吸收

唾液酸帶有極強的負電荷,通常位于細胞膜表面的糖蛋白或糖脂的末端,是細胞膜負電荷的主要來源。唾液酸的負電荷使紅細胞和其他細胞相互排斥,避免了血液循環中無意義的細胞相互作用[11]。根據異性相吸的原理,進入腸道的帶有正電荷的礦物質(如Ca2+[6])及部分維生素(如食物中含有的極其微量的維生素B12等)很容易與帶有極強的負電荷的唾液酸結合在一起。所以,唾液酸可提高腸道對于礦物質及維生素的吸收能力,補充唾液酸能夠增強機體對營養的吸收水平。

1.4 抗菌排毒、抗病毒

由于唾液酸分子的9碳氨基糖的特殊結構,消化道系統中沒有降解該物質的酶,因此,其形成的多肽結合體通過消化系統時就不會被消化道內的酶降解掉,進而進入腸道,在腸道中,特定的唾液酸多肽結合體可以與進入腸道的致病菌、毒素及病毒粒子形成競爭性結合,從而阻止腸道毒素、致病菌及病毒粒子與腸道粘膜細胞結合[12]。由此可知,在食品中添加唾液酸能夠提高腸道的抗菌、排毒及抗病毒能力。

2 唾液酸的應用

隨著科研工作者對唾液酸生物學功能的研究越來越多,唾液酸生物活性的研究已成為一個新的研究領域,唾液酸及其衍生物在食品、醫藥和疾病診斷中有廣泛的應用。

2.1 唾液酸在食品領域的應用

由于新生兒的肝臟發育尚不成熟,大腦快速生長發育需要唾液酸,而新生兒自身合成唾液酸的能力有限,因此需要補充唾液酸以滿足嬰兒生長發育的需要。研究發現,通過飲食補充外源唾液酸可以增加腦部唾液酸含量[9],這就預示著可以在嬰幼兒奶粉中添加唾液酸,以有效地促進他們的神經系統和大腦的發育,同時影響他們的智力發育。美贊臣公司認識到了嬰兒配方奶粉中唾液酸含量較低值得改進,已抓住這一先機,在其配方奶粉中增加了唾液酸的含量,使其更加接近母乳的黃金標準。將唾液酸和唾液酸衍生物添加在飲料中制成一種功能性飲料,長期飲用飲品不但可起到預防感冒的作用,還可以提高腸道對維生素及礦物質的吸收能力,提高大腦學習能力,有助于提高身體素質[13]。

2.2 唾液酸在醫藥領域的應用

隨著對唾液酸的研究,研究者們發現,唾液酸及其衍生物在抑制唾液酸酶與抗流感病毒[14]、抗副流感病毒[15]、抗輪狀病毒[16]、抗呼吸道合胞病毒[17]和抗腺病毒[18]等方面均有重要作用。目前,以唾液酸為前體,研制而成的抗流感病毒的藥物成為研究的熱點。目前,治療流感效果較好的藥物葛蘭素史克(GSK)公司開發的扎那米韋(zanamivir商品名為Relenza)已經上市,是以N-乙酰神經氨酸為前體合成的[19]。

2.3 唾液酸在疾病診斷中的應用

肝臟是蛋白質和脂肪代謝的重要器官,同時唾液酸連接到糖鏈末端也是在肝臟中進行的,因此,可以推斷肝臟疾病將會影響體內唾液酸水平[20]。肝臟分泌大量糖蛋白至血液,唾液酸連接在這些糖鏈的末端,該唾液酸能夠保證血清蛋白的穩定存在。血清唾液酸是近些年來發現的作為原發性肝癌診斷的血清標志物,并且正在日益受到臨床研究的重視[21]。肝硬化是肝癌的高危人群,血清中唾液酸水平的檢測對肝硬化的診斷和預防具有一定的價值。惡性腫瘤細胞膜分子常出現糖基化現象,在細胞識別、粘附、炎癥反應和腫瘤細胞轉移過程中起著重要作用[11]。已經發現血清唾液酸在黑色素瘤等多種腫瘤患者中明顯升高,且晚期腫瘤中最高[22]。因此唾液酸可作為腫瘤診斷的重要標志。

表1 唾液酸的來源Table 1 The source of sialic acids

3 唾液酸的生產方法

生產唾液酸的方法很多,主要包括天然原料提取法[23-27]、化學合成法[28-30]、多聚物分解法[31-32]、酶[33-37]及固定化酶法[38-40]、全細胞生物催化法[41-44]和微生物發酵法[45-47]等。

3.1 天然原料提取法

唾液酸在自然界中的分布非常廣泛,現已發現在動物、植物和微生物中都有其分布。唾液酸以糖復合物的形式廣泛的存在于動物細胞表面,表1[23-24]中列出了唾液酸含量相對豐富的天然資源。

由于燕窩中唾液酸的含量高達70‰～110‰,所以唾液酸又稱為燕窩酸。Sayama等[24]從酪蛋白中提取得到了唾液酸。Martin等[25]從燕窩中提取到了唾液酸。Juneja等[26]從禽蛋中提取的唾液酸已獲成功并已應用于生產。高劍峰等[27]從豬血中提取到了唾液酸。從天然產物中提取唾液酸要經過酸解、中和、層析、蒸發、濃縮、凍干等復雜的處理過程,而且天然產物中唾液酸含量極低,分離純化困難,從原料、成本等角度來考慮均不能滿足工業化大規模生產的需求。

3.2 化學合成法

N-乙酰甘露糖胺首先與二叔丁基氧代丁二醇的鉀鹽發生縮合,然后在堿的催化作用下脫羧形成N-乙酰神經氨酸。N-乙酰甘露糖胺在酸性醇溶液中在銦的催化作用下經α-溴甲基丙烯酸丙烯基化,然后再經過臭氧分解可得到N-乙酰神經氨酸[28]。Itzstein等[29]則以N-乙酰神經氨酸甲酯出發合成了N-乙酰神經氨酸。使用化學法合成N-乙酰神經氨酸的反應條件比較苛刻,需要銦等貴重且有毒的金屬作為催化劑,N-乙酰神經氨酸收率較低,另外,化學合成法涉及到復雜的基團保護步驟及環境保護等問題。而且,化學法合成通常和酶法合成結合起來,例如1995年,Tsukada等[30]以N-乙酰葡萄糖胺為底物,在堿性條件下異構生成N-乙酰甘露糖胺,然后再與丙酮酸在N-乙酰神經氨酸醛縮酶(又稱N-乙酰神經氨酸裂合酶)的催化作用下生成N-乙酰神經氨酸,產量為100mg·L-1。

3.3 多聚物分解法

在微生物界中,帶有K1抗原的某些大腸桿菌菌株在適當的培養基中能夠產生多聚神經氨酸[31]。因此,如果可以形成多聚神經氨酸的發酵技術,可以通過多聚神經氨酸的水解來獲得Neu5AC。Uchida等[31]成功的通過發酵獲得了多聚神經氨酸,產量為3000μg·mL-1,經微生物神經氨酸酶水解可獲得Neu5AC。通過該方法生產的Neu5AC純度高于98%,在實驗室中應用沒有任何限制,并第一次試用于工業化生產過程,多聚神經氨酸發酵技術在Neu5AC的生產過程中具有里程碑式的意義。2010年,劉金龍等[32]通過發酵方法生產的聚唾液酸含量達到了5500mg·L-1。多聚物分解法生產唾液酸產量低,成本高,而且通常要和酶法或發酵法結合起來,不適合唾液酸的大規模生產。

3.4 酶和固定化酶法

多年以前就有以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸為底物,經N-乙酰神經氨酸醛縮酶催化合成N-乙酰神經氨酸的報道[33]。1960年Comb和Roseman等[34]首次利用N-乙酰神經氨酸醛縮酶催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸縮合生成NeuAc(圖2a)。胡世元等[35]以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸為底物經過10h的發酵得到了1.01g的N-乙酰-D-神經氨酸晶體。但N-乙酰甘露糖胺價格非常昂貴,使該反應過程的應用受到限制。研究者發現N-乙酰甘露糖胺可以從N-乙酰葡萄糖胺經N-乙酰葡萄糖胺2-差向異構酶異構獲得[36]。1964年,Glosh和Roseman[37]首次報道了N-乙酰葡萄糖胺2-差向異構酶,該酶可催化N-乙酰葡萄糖胺到N-乙酰甘露糖胺的反應。用N-乙酰葡萄糖胺代替N-乙酰甘露糖胺大大的降低了酶法合成N-乙酰神經氨酸的生產成本,但需要ATP和MgCl2作為激活劑。1998年,Maru等[38]以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸為底物,連同純化的N-乙酰神經氨酸醛縮酶和N-乙酰甘露糖胺-2-差向異構酶合成了29kg的N-乙酰神經氨酸(圖2b)。此外,早在1984年,Augé等[39]就將N-乙酰神經氨酸醛縮酶固定在瓊脂糖凝膠中來生產N-乙酰神經氨酸,該固定化酶可重復利用三次,生產的N-乙酰神經氨酸為0.9g。近些年來,饒嬈等[40]以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸為底物經N-乙酰-D-神經氨酸固定化酶的催化合成了342.7mg的N-乙酰-D-神經氨酸晶體。2009年胡世元[41]等以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸為底物,通過固定化N-乙酰神經氨酸醛縮酶(NAL),產生了49.52g的N-乙酰神經氨酸,以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸為底物,通過固定化N-乙酰葡萄糖胺2-差向異構酶和N-乙酰神經氨酸醛縮酶(NAL)生產的N-乙酰神經氨酸為29.75g,該固定化酶可重復利用五次。通過酶或固定化酶法合成N-乙酰神經氨酸轉化率高,提取簡單,產品純度高,但是,通過此法合成N-乙酰神經氨酸操作步驟繁瑣,對合成所用原料要求高,價格昂貴,且需要ATP等作為異構酶的激活劑,限制了生產規模的擴大。

圖2 酶催化合成Neu5Ac的幾個階段 Fig.2 Schenmes of enzymatic catalyses for Neu5Ac production

3.5 全細胞生物催化

最初的全細胞生物催化生產N-乙酰神經氨酸的過程是偶聯Escherichiacoli和Corynebacterium

ammoniagenesDN510兩種細胞,利用大腸桿菌表達NeuAc合成酶和GlcNAc 2-異構酶,向反應體系中添加N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖合成NeuAc,產量為12.3g·L-1(圖3[42]),該法需要發酵兩種細胞,中間產物要經過跨膜才能連接下一個反應。2007年,Lee等[43]將N-乙酰葡萄糖胺2-差向異構酶和N-乙酰神經氨酸醛縮酶基因在大腸桿菌BL21(DE3)中表達,以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸為底物,生產的N-乙酰神經氨酸最大產率為10.2g·L-1·h-1。2010年,Ishikawa等[44]將N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶(slr1975)和N-乙酰神經氨酸合成酶(neuB)基因在大腸桿菌N18-14 NeuAc降解缺陷型兼醋酸鹽抗性突變株中超量表達,以N-乙酰葡萄糖胺作為底物,生產的N-乙酰產量達到了53g·L-1。2012年,Sun Wujin等[45]構建了能夠同時表達N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶(AGE)和N-乙酰神經氨酸醛縮酶(NAL)的多順反子質粒,將其在大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS中表達,以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸為底物,產生了61.3g·L-1的N-乙酰神經氨酸。通過全細胞生物催化法來生產N-乙酰神經氨酸產量比較高,無需額外添加ATP等作為異構酶的激活劑,節省了生產成本,可用于大規模生產N-乙酰神經氨酸。但仍需要以較為昂貴的N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸為底物,使其成本居高不下。

圖3 全細胞生物催化合成Neu5Ac Fig.3 Schenmes of whole-cell biocatalyses for Neu5Ac production

3.6 微生物發酵法

微生物發酵法是直接通過葡萄糖或甘油等碳源來生產N-乙酰神經氨酸,只要通過微生物直接發酵就可以獲得N-乙酰神經氨酸而不需要添加其他任何相關前體。2008年Boddy等[46]以葡萄糖為底物,敲除了N-乙酰神經氨酸運載基因nanT,N-乙酰神經氨酸醛縮酶基因nanA,超量表達了UDP-N-乙酰葡萄糖胺差向異構酶基因neuC,N-乙酰神經氨酸合成酶基因neuB和葡萄糖胺合成酶基因glmS,通過高細胞密度發酵,產生了15g·L-1N-乙酰神經氨酸。Samain等[47]敲除了大腸桿菌中的神經氨酸醛縮酶基因nanA,N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK,神經氨酸運載基因nanT,CMP-Neu5Ac合成酶基因neuA,超量表達了神經氨酸合成酶基因neuB,UDP-GlcNAc差向異構酶基因neuC,以甘油為碳源,通過高細胞密度發酵來生產N-乙酰神經氨酸,產量為39g·L-1(圖4)。Kang Junhua等[48]以葡萄糖為碳源,通過構建大腸桿菌基因工程菌,在大腸桿菌中表達了N-乙酰葡萄糖胺2-差向異構酶基因和6-磷酸葡萄糖胺乙酰轉移酶基因,去除了反饋抑制途徑,增強了主要代謝途徑,去除了N-乙酰神經氨酸的分解代謝途徑,以葡萄糖為底物生產的N-乙酰神經氨酸產量為7.85g·L-1。通過微生物發酵法生N-乙酰神經氨酸,克服了其他方法生產Neu5Ac的缺點,節省了大量的生產成本,無需酶的純化及額外添加ATP,只需一步發酵即可獲得較多的產品,純化工藝簡單。

圖4 通過代謝工程改造大腸桿菌合成Neu5Ac Fig.4 Neu5Ac production by metabolically engineered E.coli

4 展望

唾液酸的多種生理功能,決定了它可以作為一類重要的藥物前體,用于治療和預防流感病毒,用于疾病的診斷;可以作為食品添加劑添加在嬰幼兒奶粉中,使其更接近母乳中唾液酸含量,有助于提高嬰兒的智力和記憶力,增強嬰兒的免疫能力。隨著對唾液酸應用研究的進一步深入,由唾液酸衍生出來的藥物和其他產品將會不斷造福人類。為了滿足工業化大規模生產的需求,我們有理由相信微生物發酵法將會成為未來生產唾液酸的最優方法。從近些年的研究來看,微生物發酵法生產唾液酸以大腸桿菌為主。雖然大腸桿菌具有遺傳背景清楚、載體受體系統完備、生長迅速、培養簡單和重組子穩定等優點,但大腸桿菌通常會產生結構復雜、種類繁多的內毒素。用大腸桿菌生產出來的產品難免會讓使用者有后顧之憂,那么用枯草芽孢桿菌或者酵母菌等無致病性菌來發酵生產唾液酸可能會成為未來的發展方向。

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