急性淋巴細(xì)胞白血病病人Ikaros6基因表達(dá)及意義

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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266021 1 血液學(xué)教研室； 2 附屬醫(yī)院血液病研究室)

Ikaros是Kruppel家族中鋅指轉(zhuǎn)錄因子之一，其對(duì)淋巴細(xì)胞分化、增殖和功能維持具有重要的調(diào)控作用[1-4]。編碼Ikaros蛋白的基因(IKZF1)由N端4個(gè)結(jié)合DNA的鋅指域和C端有2個(gè)蛋白相互作用的鋅指域構(gòu)成，其基因外顯子的不同剪接轉(zhuǎn)錄可以編碼至少12種不同的鋅指蛋白(Ikaros1～I(xiàn)karos12)，均具有不同的DNA結(jié)合能力及特異性[3]。Ikaros要發(fā)揮結(jié)合DNA作用至少需要3個(gè)N端的鋅指結(jié)構(gòu)，而一旦缺失兩個(gè)或以上的鋅指結(jié)構(gòu)，其蛋白與DNA結(jié)合能力就會(huì)下降，也不具備轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)也會(huì)抑制其他異構(gòu)體對(duì)DNA的結(jié)合能力，表現(xiàn)為顯性負(fù)效應(yīng)(DN)[5]。有研究表明，Ph染色體陽(yáng)性的急性淋巴細(xì)胞白血病(Ph+-ALL)病人中Ikaros6 基因的突變率較高、治療效果差[6-9]。但絡(luò)氨酸酶抑制劑(TKIs)和VDCP這兩種治療方案對(duì)Ph+-ALL病人的治療效果尚未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。本研究旨在進(jìn)一步明確Ikaros6基因異常表達(dá)與Ph+-ALL治療效果的相關(guān)性。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

2011年7月—2013年7月，在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院各附屬醫(yī)院就診的ALL病人95例，男46例，女49例；年齡16～82歲，中位年齡49歲。Ph+-ALL病人分別接受TKIs聯(lián)合化療治療和僅VDCP(長(zhǎng)春新堿(VCR)、柔紅霉素(DNR)、環(huán)磷酰胺(CTX)、強(qiáng)的松(Prec))治療。因Ph染色體陰性的ALL(Ph--ALL)病人Ikaros6基因表達(dá)低，故不再進(jìn)行跟蹤隨訪。以上病人的診斷、治療及療效判定標(biāo)準(zhǔn)均參照文獻(xiàn)[10]。選擇10例健康體檢者為健康對(duì)照組，男5例，女5例；年齡18～58歲，中位年齡38歲。

1.2 染色體核型分析

將ALL病人骨髓細(xì)胞按(1～2)×109/L的密度接種于RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，于收獲前1 h，加入0.05 mg/L秋水酰胺終止反應(yīng)[11]。采用氣干法制片進(jìn)行染色體R顯帶；每例病人于油鏡下分析10～20個(gè)分裂中期細(xì)胞，依據(jù)《人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(1995)》觀察有無(wú)染色體異常。

1.3 RT-PCR檢測(cè)Ikaros6基因表達(dá)

1.3.1總RNA提取 取肝素抗凝的骨髓液2 mL，加等量的人淋巴細(xì)胞分離液，以2 000 r/min 離心15 min，分離單個(gè)核細(xì)胞，加Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)1 mL，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取并檢測(cè)RNA純度(A260/A280>1.60)及完整性(28S、18S、5S等3條清晰亮帶)。

1.3.2cDNA合成 應(yīng)用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)合成cDNA。反應(yīng)體系20 μL，含總RNA 1 μg、0.5 g/L的OLigo(dT)18引物1 μL，使用DEPC水補(bǔ)充至12 μL；快速輕微離心后，置65 ℃孵育5 min，立即置于冰上；然后依次加入5×緩沖液4 μL、RNase抑制劑1 μL、10 mmoL/L dNTP Mix 2 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MuLV) 1 μL混勻，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系10 μL，含逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，20 μmol/L的Ikaros6正、反義鏈引物各0.5 μL，5×PCR Mix 5 μL，用DEPC水補(bǔ)至10 μL。PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。所用引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，Ikaros6 正義鏈為5′-CGACGCACAA-ATCCACATAA-3′，反義鏈為5′-GCAGCAGCAGGTTCTCCAC-3′。

1.4 基因測(cè)序

將標(biāo)本外送到金斯瑞生物科技公司進(jìn)行純化并測(cè)序。運(yùn)用BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果和正常序列(基因庫(kù)ID:NM006060)進(jìn)行比對(duì)，確定相對(duì)應(yīng)的突變位置和類(lèi)型[12]。

1.5 熒光定量PCR檢測(cè)Ikaros6基因的表達(dá)

1.5.1熒光定量PCR反應(yīng) PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，含10 mg/L 模板DNA 5 μL，20 μmol/L的Ikaros6正、反義鏈引物各0.5 μL，F(xiàn)ast Start Universal SYBR Green Master 25 μL和DEPC水19 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，62 ℃退火、延伸60 s，40個(gè)循環(huán)。然后進(jìn)行熔解曲線分析，由62 ℃始以0.1 ℃/s上升至96 ℃，最后冷卻至40 ℃。Ikaros6引物和1.3.3中所用引物相同，設(shè)內(nèi)參照GAPDH，引物序列為：正義鏈5′-C-AAGGTCATGACAACTTTG-3′，反義鏈5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.5.2熒光定量PCR結(jié)果計(jì)算 Ikaros6 mRNA相對(duì)表達(dá)量以2-△△CT表示，△△CT=(△CTIkaros6初診-△CT內(nèi)參照)-(△CTIkaros6緩解-△CT內(nèi)參照)[12]。其中CT值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。兩組間計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有顯著意義。

2 結(jié) 果

2.1 ALL病人染色體核型分析

本文95例ALL病人中，45例檢測(cè)到Ph染色體，其中38例為典型易位即t(9;22)(q34;q11)，7例為變異易位；50例未檢測(cè)到Ph染色體。

2.2 Ikaros6基因的表達(dá)

本文45例Ph+-ALL病人中有13例(28.9%)表達(dá)Ikaros6基因，50例Ph--ALL病人中僅有2例(4.0%)表達(dá)該基因，Ph+-ALL病人Ikaros6基因表達(dá)率明顯高于Ph--ALL病人(χ2=11.03，P<0.05)。健康對(duì)照組中均未檢測(cè)到Ikaros6基因的表達(dá)。見(jiàn)圖1。

2.3 Ikaros6基因測(cè)序

對(duì)克隆篩選出來(lái)的表達(dá)Ikaros6基因的標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)Ikaros6基因突變是由于IKZF1中外顯子4～7的缺失所致。見(jiàn)圖2。

M：Marker 2000；①、②表達(dá)Ikaros6基因；③、④分別表達(dá)Ikaros1和Ikaros2基因。

圖2 Ikaros6基因測(cè)序圖

2.4 Ikaros6基因與臨床療效

2.4.1Ph+-ALL病人初診時(shí)和緩解后Ikaros6基因表達(dá)的比較 12例初診病人Ikaros6 mRNA平均表達(dá)量(△△CT=3.4)明顯高于緩解后(△△CT=5.0，11例，1例病人始終未達(dá)到血液學(xué)上的緩解)，差異有顯著性(t=4.054，P<0.05)。

2.4.2Ikaros6基因表達(dá)與初診病人短期緩解率表達(dá)Ikaros6基因的病人中，6例接受TIKs治療僅1例(16.67%)獲得緩解，7例接受VDCP治療有2例(28.57%)獲得緩解，兩組比較差異無(wú)顯著意義(P>0.05)。未表達(dá)Ikaros6基因的病人中，7例接受TIKs治療6例(85.71%)獲得緩解，25例接受VDCP治療僅9例(36.00%)獲得緩解，兩組比較差異有顯著性(χ2=5.43,P<0.05)。接受TIKs治療的病人中，表達(dá)Ikaros6組的緩解率明顯低于未表達(dá)Ikaros6組(16.67% vs 85.71%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.20,P<0.05)。接受VDCP治療的病人中，表達(dá)Ikaros6組和未表達(dá)Ikaros6組的緩解率(28.57% vs 36.00%)比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

2.4.3Ikaros6基因表達(dá)與累積復(fù)發(fā)時(shí)間 經(jīng)隨訪，Ph+-ALL病人中表達(dá)Ikaros6基因者20個(gè)月平均累積復(fù)發(fā)時(shí)間明顯短于未表達(dá)Ikaros6基因者(4.6月vs 12.2月；Waldχ2=13.72,P<0.05)。

3 討 論

Ph染色體是成人ALL最常見(jiàn)的重現(xiàn)性細(xì)胞遺傳學(xué)異常，約占20%～30%，它也是影響ALL預(yù)后的重要因素之一。如何對(duì)ALL進(jìn)行快速診斷、分類(lèi)并作出相應(yīng)的合理治療，已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。Ikaros在造血細(xì)胞，特別是B細(xì)胞的發(fā)育和分化中具有重要的作用，Ikaros基因一旦發(fā)生突變，轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)將會(huì)進(jìn)一步減少或抑制正常功能基因亞型與DNA的結(jié)合，最終引發(fā)相應(yīng)白血病。然而，在ALL病人中，異常的Ikaros6 基因表達(dá)與急性白血病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等方面是否有關(guān)聯(lián)，至今尚無(wú)明確的結(jié)論。

本研究結(jié)果顯示，IKZF1中外顯子4～7的缺失是導(dǎo)致Ikaros6基因表達(dá)的主要原因，該基因在Ph+-ALL病人中高表達(dá)，與IACOBUCCI等[7]和MARTINELLI等[9]的研究結(jié)論基本一致。說(shuō)明Ikaros6基因突變能抑制或減少正常基因活性，是Ph+-ALL發(fā)病機(jī)制的重要因素。然而，Ikaros6基因陽(yáng)性的Ph+-ALL具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為可能與以下因素有關(guān)：Ikaros基因與前B細(xì)胞中c-myc的啟動(dòng)子結(jié)合，抑制前B細(xì)胞中c-myc的表達(dá)，Ikaros6 基因抑制或減少其他Ikaros基因與DNA的結(jié)合，從而引起c-myc基因高表達(dá)，導(dǎo)致前B細(xì)胞的過(guò)度增生[13]；Ikaros基因可以調(diào)節(jié)B細(xì)胞中JAK-STAT信號(hào)通路[14]，突變的Ikaros6基因可不斷激活該信號(hào)通路，從而導(dǎo)致B細(xì)胞過(guò)度增生。

熒光定量PCR是一種核酸定量技術(shù)，其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，故本研究采用該方法檢測(cè)Ikaros6陽(yáng)性病人mRNA表達(dá)量。結(jié)果顯示，初診時(shí)Ikaros6 mRNA具有較高的表達(dá)量，這可能與Ikaros6 mRNA轉(zhuǎn)錄的動(dòng)態(tài)表達(dá)量和臨床分期相關(guān)，在疾病的初發(fā)期，其轉(zhuǎn)錄水平明顯增高，治療達(dá)到緩解后，其表達(dá)量明顯下降。

通過(guò)隨訪顯示，未表達(dá)Ikaros6 基因的病人，采用TKIs治療可獲得較高的緩解率，目前仍然是最佳的治療方案，而Ikaros6基因陽(yáng)性表達(dá)的病人，兩種治療方案的緩解率均較低，這說(shuō)明在Ph+-ALL病人中，Ikaros6基因表達(dá)對(duì)TKIs具有明顯的抵抗性。MARTINELLI等[9]的研究結(jié)果顯示，在Ph+-ALL病人中，異常的Ikaros6基因表達(dá)與抵抗TKIs的治療之間存在一定的相關(guān)性。本文的研究結(jié)果與其一致。CHARLES等[15]的研究結(jié)果也表明，Ikaros6 基因表達(dá)與B-ALL病人的預(yù)后不良存在聯(lián)系。目前TKIs治療Ph+-ALL病人的療效尚存在不同意見(jiàn)，VIGNETTI等[16]認(rèn)為，Ph+-ALL病人接受TKIs治療有較高的完全緩解率，接近98%～100%，這可能與不同種族及樣本量的多少有關(guān)。

Ph+-ALL病人中表達(dá)Ikaros6基因者20個(gè)月平均累積復(fù)發(fā)時(shí)間明顯短于未表達(dá)Ikaros6基因者，陽(yáng)性表達(dá)病人均在1年內(nèi)復(fù)發(fā)。說(shuō)明Ikaros6基因在Ph+-ALL的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，并與病人的療效和預(yù)后有著密切的聯(lián)系。同時(shí)，表達(dá)Ikaros6基因的Ph+-ALL病人對(duì)TKIs的治療具有抵抗性，且治療后易復(fù)發(fā)。

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